Az életkor hatása az agyi ödéma kialakulására, a másodlagos agykárosodásra és a gyulladásos válaszra az egerek agytraumája után

Egyetemi Orvostudományi Központ Aneszteziológiai Tanszéke, Johannes Gutenberg-Egyetem, Mainz, Németország

Egyetemi Orvostudományi Központ Aneszteziológiai Tanszéke, Johannes Gutenberg-Egyetem, Mainz, Németország

Társulás Aneszteziológiai Tanszék, Egyetemi Orvosi Központ, Johannes Gutenberg-Egyetem, Mainz, Németország, Focus Program Translational Neuroscience, Johannes Gutenberg-Egyetem, Mainz, Németország

Egyetemi Orvostudományi Központ Aneszteziológiai Tanszéke, Johannes Gutenberg-Egyetem, Mainz, Németország

Ralph Timaru-Kast,
Clara Luh,
Philipp Gotthardt,
Changsheng Huang,
Michael K. Schäfer,
Kristin Engelhard,
Serge C. Thal

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Timaru-Kast R, Luh C, Gotthardt P, Huang C, Schäfer MK, Engelhard K és mtsai. (2012) Az életkor hatása az agyi ödéma kialakulására, a másodlagos agykárosodásra és a gyulladásos válaszra az egerek agytraumája után. PLoS ONE 7 (8): e43829. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043829

Szerkesztő: Christoph Kleinschnitz, Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Németország

Fogadott: 2012. április 20 .; Elfogadott: 2012. július 30 .; Közzétett: 2012. augusztus 30

Finanszírozás: Ezt a munkát a Johannes Gutenberg-Egyetem Focus Program Translational Neurosciences támogatása támogatta az SCT számára. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Jelen vizsgálat célja annak tisztázása volt, hogy az életkor befolyásolja-e a funkcionális kimenetelt, a szisztémás és agyi gyulladást, valamint a másodlagos agykárosodást kontrollált kérgi ütközéses sérülésnek kitett fiatal (2 hónapos) és idős (21 hónapos) egerekben.

Eredmények

Halálozás

Halandóság az állatok elhelyezése során.

Az állatok a kísérletek kezdetéig 630 napig tartózkodtak állattartó létesítményünkben. 55 állatból 29 egér élte túl ezt az időtartamot (kumulatív mortalitás 45%, lásd Kaplan Meyer görbe, 1. ábra A).

V: A régi állatcsoport túlélési arányának Kaplan-Meyer görbéje. Az állatok a kísérletek kezdetéig 630 napig éltek az állattartó létesítményben. 55 állatból 29 egér élte túl ezt az időtartamot (túlélési arány 45%). A túlélési görbe a halálozás drámai növekedését mutatja a kísérletek előtti utolsó hónapokban. B: A szisztolés vérnyomás [mmHg] nem invazív módon mért ébren lévő állatokban mindkét korcsoportban a CCI előtt, valamint a kísérleti TBI után 6 és 24 órával. A traumát megelőzően a fiatal állatok szisztolés vérnyomása magasabb volt, mint az idős egerekben. C: A fiatal (világosszürke, n = 6) és az öreg (sötétszürke n = 6) naiv állatok agyi félteke térfogatainak szövettani értékelése azt mutatta, hogy mindkét félteke szignifikánsan nagyobb volt a fiataloknál (p 1. táblázat. I. élettani paraméterek: peritraumatikus vérnyomás és testhőmérséklet.

Félgömb agy térfogata

A naiv állatok agyméretét összehasonlítottuk mindkét korcsoportban. A 2 hónapos állatok agya 8% -kal nagyobb, mint a 21 hónapos állatoké (p 3 (elsődleges sérülés, 15 perc TBI után) 24,6 óra után 32,6 ± 7,7 és 32,5 ± 3,6 mm 3, valamint 38,2 ± 7,3 és 40,1 ± 12,1 mm 3, 72 óra elteltével fiatal és idős állatokban. Az agy méretbeli különbségeinek korrigálása érdekében az elváltozások térfogatát az ellenoldali féltekék százalékában is kiszámolták (3 B ábra). Az elváltozások mennyisége a CCI után 24 órával jelentősen nőtt az elsődleges sérüléshez képest (2 hónap: 10,6 ± 3,2%; 21 hónap: 12,9 ± 1,8%) 20,0 ± 4,5% -ra (2 hónap) és 20,3 ± 2,6% -ra (21 hónap; p 2. ábra Tipikus képek a Nissl által festett koronaszelvényekről bregma szinten −0,98 - −1,28 mm 2 hónapos és 21 hónapos egereknél 15 perccel (A; B), 24 (C; D) és 72 (E; F) órával később. ellenőrzött kérgi ütközési sérülés.

A képek a traumás agysérülés utáni első három napban mutatják be az elváltozás növekedését a korcsoportok közötti különbség nélkül (lásd még az elváltozás számszerűsítését), 3. ábra A, B).

Neurofunkcionális eredmény

A neurológiai funkciót egy neurológiai súlyossági pontszámmal (NSS, [14]) határoztuk meg egy órával a CCI előtt (kiindulási érték), valamint 24 és 72 órával a CCI után (3. ábra C). A CCI előtt minden fiatal állat neurológiai hiány nélkül végezte a feladatokat (0 ± 0 pont); mivel néhány idős állat kissé romlott pontszámot mutatott (1,2 ± 1,1 pont; p 3. táblázat. Az agyi gyulladásos citokin expresszió értékelése naiv állatoknál.

Már 15 perccel az inzulin IL1β expressziója után (4. ábra A, B) megnövekedett az elváltozással szembeni ipsilaterális oldalon, és független volt a kortól a naiv 315 ± 213% -áig (2 hónap) és a naiv 427 ± 182% -áig (21 hónap), míg az expresszió stabil maradt az ellenoldali féltekékben (2 hónap: 163 ± 98% a 21 hónap: a naivak 156 ± 52% -a). Az expresszió idős állatoknál 24 óra elteltével érte el a maximumot (2003 7 ± 15676% naiv), összehasonlítva a fiatal állatokkal (a naivak 995 ± 590% -a). Ezzel szemben a fiatal állatok késéssel növekedtek 72 órával a sértés után (a naivak 11229 ± 4112% -a), ami szintén kevésbé volt kifejezett a régi állatokhoz képest (a naivak 21653 ± 22305% -a). A kontralaterális féltekén az IL1β expressziót a traumát követő 24 órában nem befolyásolták 2 hónapos állatoknál (a naivak 247 ± 239% -a), míg az öreg állatoknál az IL1β expresszió szignifikánsan növekedett, és elérte a naiv maximális 980 ± 744% -át. Ezzel szemben a fiatal állatok késleltetett és erősebb csúcsot mutattak a TBI után 72 órával (a naiv 5302 ± 2947% -a), míg az IL1β expresszió az öreg állatoknál a naivak 697 ± 504% -ára esett vissza. Az adatok arra utalnak, hogy az IL1β expresszió késői és kétoldalú kezdeteket mutat fiatal állatoknál, míg az öreg állatoknál az IL1β elsősorban ipsilaterálisan növekszik a károsodáshoz 24 órán belül.

Az interleukin 1β (IL1β; B), tumor-nekrózis-faktor α (TNFα; C és D) és interleukin 6 (IL6; E és F) fiatal (2 hónap, világosszürke) és öreg (21 hónap, sötétszürke) C57/Bl6 egerekben határoztuk meg 15 percnél (= 15 m, n = 6), 24 órán át (= 24 óra, n = 7) és 72 órával (= 72 óra, n = 7) a CCI után (az adatokat a ciklofilin A háztartási génre normalizáltuk, és átlag ± SD-ként adtuk meg a korral egyeztetett naiv állatok% -ában; a p-értékeket a Bonferroni többszörös összehasonlítás céljából állította be).

A TNFα-profil gén expressziója hasonló mintát mutatott a korai, elsősorban egyoldalú gyulladásos válaszra idős állatokban, mint a fiatal állatok késői és globális felfelé történő szabályozására (4. ábra C, D). Fiatal állatokban a TNFα expresszió késleltetett csúccsal nőtt a sértés után 72 órával az ipsilateralis (15 perc: a naivak 710 ± 285% -a; 24 óra: a naivak 284 ± 1323% -a; a naivak 72 óra: 47204 ± 8849%) és kontralaterális félgömbök (15 perc: a naivak 215 ± 63% -a; 24 óra: a naivak 721 ± 456% -a; 72 óra: a naivak 43406 ± 16053% -a). Idős állatokban a TNFα expresszió a sértés után már 24 órával tetőzött, elsősorban ipsilateralisan (15 perc: a naivak 1168 ± 571% -a; 24 óra: a naivak 1804 ± 11765% -a; a naivaknál 72 óra: 15527 ± 12985%) és alacsonyabb mértékben a kontralaterális félteke (15 perc: a naivak 249 ± 108% -a; 24 óra: a naivak 2247 ± 1943% -a; a naivak 72 óra: 689 ± 281%).

Az utóbbi génekkel ellentétben az IL6 expressziója másképp volt szabályozva (4. ábra E, F). 15 perccel azután, hogy a TBI expressziója nem változott sem ipsilateralisan (2 hónap: a naiv 228 ± 54% -a; 21 hónap: a naivnál 251 ± 70%), sem kontralaterálisan (2 hónap: a naivnál 210 ± 78%; 21 hónap: 155 ± 64%) naiv) az elváltozásra. A károsodott féltekén az IL6 expressziója növekedett az életkortól függetlenül (2 hónap: a naivak 15147 ± 14930% -a; 21 hónap: a naivak 10018 ± 9360% -a), és 72 óra (2 hónap: a naiv 3985 ± 1575% -a) emelkedett maradt; 21 hónap: A naivak 4241 ± 3144% -a). A kontralaterális féltekén a CCI után 24 órával nem volt szignifikáns növekedés (2 hónap: a naivak 592 ± 570% -a; 21 hónap: a naivak 689 ± 623% -a). A fiatal állatok a TBI után 72 órával növekedést mutattak (a naivak 3942 ± 2074% -a), míg az öreg állatoknál az ellenoldali IL6 génexpresszió 72 órával a CCI után visszatért az alapszintre (a naiv 177 ± 134% -a). Így az ipsilaterális féltekén mindkét korcsoportban korai és tartós az IL6 szabályozása, de a kontralaterális régióban 72 óra elteltével a fiatal állatok csak későn növekednek.

Az intracerebrális T-sejtek migrációja

IL1β, IL6, COX2 és iNOS pulmonális mRNS expressziója

Az IL1β expressziója a tüdőben felfelé volt szabályozva a fiatal állatokban (15 perc: a naivak 187 ± 69% -a; 24 óra: a naivak 265 ± 140% -a; 72 óra: a naivak 314 ± 145% -a; p 4. táblázat: A vér mennyiségi meghatározása differenciális sejtszám.

Mindkét korcsoportban a fehérvérsejtszám (WBC) 15 perccel nőtt a TBI után, anélkül, hogy elérte volna a szignifikancia szintjét (p = 0,067 és p = 0,381 fiatal és idős egerekben). Öreg állatoknál a TBI után 24 órával a fehérvérsejt-szabályozás alacsony volt a 15 perces értékekhez képest (p + sejtek detektálhatók a pericontusionalis szövetben. 72 óra elteltével a második növekedés magasabb volt a 24 órához képest. Az kontralaterális féltekén 72 óra elteltével kevésbé volt szignifikáns növekedés. A fiatal egerekkel ellentétben az idős állatoknál a T-sejtek alacsonyabb növekedést mutattak a perikontuszionális szövetben 3 nap elteltével, míg a kontralaterális féltekén a T-sejtek migrációja nem volt megfigyelhető. citokin expressziós mintázat, a CD3-pozitív T-sejtek mennyiségi meghatározása kétoldalú neuroinflammatorikus választ mutat a T-sejtek migrációjával kapcsolatban a harmadik posztraumás napon fiatal állatokban, összehasonlítva az egyoldalúbb posttraumás gyulladásos reakcióval idős állatokban.

Következtetések

Jelen tanulmány azt sugallja, hogy a hisztopatológiailag kimutatható másodlagos agykárosodáson túl más mechanizmusok is felelősek lehetnek a TBI-t követő idős egerek károsodott neurológiai kimeneteléért. A régi agy csökkent plaszticitása, magasabb fokú ödéma képződése és megváltozott gyulladásos reakcióminta, a T-sejtek migrációjának és a pleiotróp gyulladásos citokinek expressziójának különbségeivel, valamint a korábban kialakuló és tartósabb agyi gyulladásos válasz hozzájárulhat az öregek rossz funkcionális helyreállításához állatok [9], [13], [23], [24], [37]. Az idős agyak képessége az agyi traumák utáni idegsejt-veszteség kompenzálására nagymértékben romlik. Ezért foglalkozni kell az életkornak a TBI-ből való felépülésének hatásával [70], hogy olyan terápiás beavatkozásokat dolgozzunk ki, amelyek az öreg agy speciális problémáira irányulnak. A korspecifikus különbségek megértésére és csökkentésére irányuló stratégiák segíthetnek a farmakológiai beavatkozás fejlesztésében az idős népesség számára.

Anyagok és metódusok

Összesen 73 hím C57Bl6N egeret (Charles River Laboratory, Sulzfeld, Németország) vizsgáltak. Fiatal felnőtt (2 hónapos; 21,2 ± 2,0 g) egereket hasonlítottunk a 21 hónapos korú állatokhoz (46,8 ± 7,8 g). Ezt a vizsgálatot a mainzi Johannes Gutenberg-Egyetem intézményi irányelveinek megfelelően végezték el. Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés és az állatok számának minimalizálása érdekében. A Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz Állatgondozási és Etikai Bizottsága minden kísérletet jóváhagyott (protokollszám: G07-1-021). Az állatokat ellenőrzött fény- és környezeti körülmények között tartottuk (12 órás sötét/világos ciklus, 23 ± 1 ° C, 55 ± 5% relatív páratartalom), és előtte minden alkalommal hozzáférhettek élelemhez (Altromin, Németország) és vízhez. a kísérletek után.

Traumatikus agysérülés és kísérleti csoportok

A sebek lezárása után mindkét korcsoportba tartozó állatokat véletlenszerűen soroltuk be: 15 perc, 24 és 72 óra túlélésre a CCI és a sevoflurán abbahagyása után. Azok az állatok, akik a CCI után 15 percet túlélték, az agyuk eltávolításáig maradtak és a vért elvették az artériás vérgázelemzéshez a hemoglobin-koncentráció, a hematokrit, az elektrolit és a vércukorszint szempontjából (ABL800 BASIC vérgázelemző, Radiometer Medical ApS, Brønshøj, Dánia). A 24 és 72 órás túlélési csoportokban az állatokat egyedi ketrecükbe helyeztük, és hagytuk 6 órán át helyreállni 33 ° C-ra melegített inkubátorban, 35% -os páratartalom mellett (IC8000, Draeger, Németország). Az agyödéma képződését 24 órával a kísérleti TBI után értékeltük. A szövettani agykárosodást 15 perccel, 24 és 72 órával a trauma után határoztuk meg. A CCI-csoportokat összehasonlítottuk mindkét korcsoport naiv - nem operált - állataival. A neurológiai értékelést a trauma előtt, valamint a TBI után 24 és 72 órával végeztük. Az idegsejtek gyulladásának számszerűsítését perikontuszionális és kontralaterális agyszövetben végeztük génexpressziós elemzéssel. A következő kísérleti csoportokat használtuk.

Kísérleti csoportok (célparaméterek, csoportméret):

Naiv állatok, műtét nélkül (hematológia, neurológia, szövettan és gyulladás):
1. 2 hónap: n = 6 (n = 6 túlélt)
2. 21 hónap: n = 6 (n = 6 túlélt)
15 perc túlélés (fiziológia, hematológia és szövettan):
1. 2 hónap: n = 6 (n = 6 túlélt)
2. 21 hónap: n = 6 (n = 6 túlélt)
24 órás túlélés (hematológia, neurológia, szövettan és gyulladás):
1. 2 hónap: n = 7 (n = 7 túlélt)
2. 21 hónap: n = 7 (n = 7 túlélt)
24 órás túlélés (vérnyomás, neurológia és agyi víztartalom):
1. 2 hónap: n = 8 (n = 8 túlélt)
2. 21 hónap: n = 10 (n = 8 túlélt)
72 órás túlélés (hematológia, neurológia, szövettan és gyulladás):
1. 2 hónap: n = 7 (n = 7 túlélt)
2. 21 hónap: n = 9 (n = 7 túlélt)

A funkcionális eredmény számszerűsítése

A CCI funkcionális eredményét a CCI előtt és után a kísérleti csoportok felé megvakult vizsgálók határozták meg a testsúly mérésével és a neuroscore értékelésével. Tízpontos neurológiai súlyossági pontszámot (NSS) alkalmaztunk Tsenter et al. [14]. A neuroscore 10 különböző feladatból áll, amelyek kiértékelik a motoros képességeket, az éberséget, az egyensúlyt és az általános viselkedést. Egy pontot ítéltek meg egy feladat sikeres teljesítésének elmulasztása miatt. Az egészséges egerek minden feladatban sikeresek voltak, és 0 pontot kaptak. A súlyosan károsodott állatok legfeljebb 10 pontot kaptak (5. táblázat).

Szövettani értékelés és immunhisztokémia

Az agy víztartalmának meghatározása

Az állatokat 24 órával a CCI után újra érzéstelenítettük. Az agy eltávolítása után a kisagyat elválasztották, és a félgömböket az interhemisphere sík mentén levágták. Mindkét féltekét lemértük nedves súlyuk felmérése céljából. A félgömböket 24 órán át 110 ° C-on szárítottuk a száraz tömeg meghatározása céljából. A gravimetriai különbségek alapján az agy víztartalmát a következő számítással nyertük [75]: Félgömb víztartalma (%): (WW - DW)/WW × 100, ahol WW a nedves tömeg (g) és DW, az agyféltekék száraz tömege (g).

Hematológiai értékelés

Vérmintákat vettünk a bal szívkamrából mély érzéstelenítésben a lefejezés előtt, a fentiek szerint, és EDTA-ban tároltuk. A vérsejteket automatikusan megszámoltuk fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással (FACS). A hematológiai értékelést a Johannes Gutenberg Egyetem Mainzi Orvosi Központ Laboratóriumi Orvostudományi Intézetének laboratóriumában végezték, speciálisan programozott FACS eszközökkel rágcsálók vérmintáihoz.

A génexpresszió elemzése

Statisztikai analízis

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Traumatikus agysérülés" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Agykárosodás" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Gyulladás" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Korcsoportok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "T-sejtek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Citokinek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Vérnyomás" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Ödéma" alkalmazható erre a cikkre? igen nem