Fiatal Tudós Folyóirat

ABSZTRAKT

Az elhízás az egyik legelterjedtebb egészségügyi probléma az Egyesült Államokban. Azok az egyének, akik elhízottak, fokozottan veszélyeztetik más egészségügyi problémák, például szívbetegségek, magas vérnyomás és 2-es típusú cukorbetegség kialakulását. Nem teljesen érthető, hogy az elhízott embereknek miért van ez a fokozott kockázat, de az immunrendszerrel nemrégiben kapcsolat alakult ki egy alacsony fokú gyulladást magában foglaló mechanizmus révén. Ebben a projektben magas zsírtartalmú étrendet alkalmaztak egerek elhízásának kiváltására az emberek elhízásának modellezésére, míg alacsony zsírtartalmú étrendet alkalmaztak a sovány egerek kontrolljaként. A magas Ly-6C-szintet expresszáló monocitákat gyulladásgátló hatásuk miatt speciálisan megvizsgálták. Fluoreszcenciával aktivált sejtválogatás és hagyományos mikroszkópia segítségével meghatároztuk a Ly-6C magas monociták prevalenciáját sovány és elhízott egerek lépben és fehér zsírszövetében. Az eredmények azt mutatják, hogy az étrend okozta elhízás egerekben mindkét szövetben növelte a Ly-6C magas monociták számát. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a gyulladáscsökkentő monociták szerepet játszhatnak az elhízással járó krónikus gyulladás kialakulásában.

BEVEZETÉS.

Az elhízás az emberek egyik legelterjedtebb globális egészségügyi problémájává vált. Számtalan egészségügyi probléma társul az állapothoz, mert növeli az egyéb betegségek kialakulásának kockázatát, mint például a szív- és érrendszeri betegségek, a metabolikus szindróma és a 2-es típusú cukorbetegség [1]. Az elhízás akkor alakul ki, amikor a szervezet túlzott zsírlerakódása a szervezet fehér zsírszövetében (WAT) történik. Gyakran alacsony fokú krónikus gyulladás jellemzi, amely az elhízással kapcsolatos betegségek kialakulásának fő tényezője [1].

Az immunológiai területen régóta fennálló hipotézis az volt, hogy a monociták egyike azon kevés immunsejteknek, amelyek az egész testben állandó keringésben vannak. Úgy gondolták, hogy ezek a keringési monociták csak szövetbe jutás után tudnak differenciálódni makrofágokká vagy dendritikus sejtekké [2]. Ezzel az elképzeléssel ellentétben a lépről kiderült, hogy a monociták tárolójaként szolgál, ezért a monociták kimutatása nem szigorúan keringő [2]. Ezenkívül ezek a lép monociták a lépből a test körüli különböző gyulladásos helyekre telepíthetők. A monocitáknak két alcsoportja található meg a lépszövetekben, ezek a Ly6c magas monociták és a Ly6c alacsony monociták [2]. A gyulladáscsökkentő Ly6c magas monociták felelősek a károsodott szövetek emésztéséért, míg a Ly6c alacsony monociták gyulladáscsökkentők, és elsősorban a gyulladás feloldásában és a sebgyógyulás elősegítésében vesznek részt [2].

A mieloid mononukleáris sejtek egy másik alcsoportját, a zsírszöveti makrofágokat (ATM) gyakrabban tanulmányozták az elhízással való kapcsolatuk tekintetében. Nevezetesen az egyik megállapította, hogy az ATM-ek felhalmozódnak a WAT-ban, és jelentős szerepet játszanak az elhízással kapcsolatos gyulladásban [1]. Ezek az ATM-ek ezután szaporodhatnak és elősegíthetik a myelopoiesist, a myeloid immunsejtek termelését és a monocytosisot, a monociták termelését, különösen akkor, ha egy szervezet elhízott [1].

Az ATM-ek gyakrabban a zsigeri zsírszövetben találhatók, nem pedig a szubkután zsírban, amely közvetlenül a bőr alatt fekvő zsírréteg [3]. A zsigeri zsírszövet olyan zsírszövet, amely a hasüregben található és felhalmozódhat a szervek körül. Ez az a fajta zsír, amely elhízott egyénekben felhalmozódhat. Bár az elhízás elősegítheti a makrofágok szaporodását a zsírszövetben, nem növeli azok szaporodását más szövetekben [3]. Ez a bizonyíték arra készteti a kutatókat, hogy feltételezzék, hogy a zsírszöveten belül egyedülálló környezet van, amely szükséges az elhízott körülmények között fellépő megnövekedett monocita és makrofág proliferáció és akkumuláció elősegítéséhez [3].

Mivel a lép hozzájárul a gyulladásgátló monociták gyulladásos körülmények között történő bevezetéséhez, és az a tény, hogy a monociták makrofágokat eredményezhetnek a WAT-ban, ez a kutatási projekt arra törekedett, hogy felmérje, hogy a gyulladásgátló monociták megnövekedtek-e a zsírszövetben vagy sem. elhízott környezetben. A lépet további elemzéssel megvizsgáltuk, hogy ez a szerv a Ly6c magas monocitákat juttatta-e a zsírszövetbe, mint egy gyulladásos helyre. Feltételezik, hogy az elhízás korrelál a gyulladásgátló monociták zsírszövetben való lokalizációjával, valamint a lép monociták toborzásával. Ez az eredmény azt eredményezné, hogy kevesebb monocita található a lépben, ha egy szervezet elhízott. Az immunsejtek lokalizációjának teljesebb leírása hasznos lehet abban, hogy a kutatók jobban megértsék az elhízással járó gyulladást, és ezért kezeljék az elhízással kapcsolatos gyulladás egyik aspektusát.

MÓD.

Elhízás kiváltása.

A tanulmány az étrend okozta elhízást (DIO) használta egereken az elhízás modellezésére. Hím vad típusú C57BL/6J (B6) vad egereket alkalmaztak a DIO iránti érzékenységük miatt. A kísérleti egereknek 12 héten keresztül magas zsírtartalmú étrendet (HFD) adtak az elhízás kiváltására. A kontroll egerek alacsony zsírtartalmú étrendet (LFD) kaptak, hogy összehasonlítási alapot szolgáltassanak. 12 hét után a teszt étrenden lépet és zsírszövetet nyertünk elemzés céljából.

Stromális vaszkuláris frakció izolálása a fehér zsírszövetből.

A peri-gonadalis viscerális fehér zsírszövetet ledaráltuk és 37 ° C-on 1 órán át emésztettük 10 ml Collegenase I oldat (1 mg/ml RPMI 1640 tápközegben) alkalmazásával. Az emésztési folyamatot 40 ml mosóközeg (5% magzati szarvasmarha-szérum (FBS) tartalmú RPMI 1640 táptalaj) hozzáadásával állítottuk le az egyes mintákhoz. A mintákat ezután 1300 fordulat/perc sebességgel 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk és a a vörösvértesteket 0,5 ml ACK lizáló puffer alkalmazásával 5 percig lizáltuk. Miután 10 ml mosóközeg hozzáadásával leállítottuk ezt a reakciót, a sejteket ezután azonos körülmények között még egyszer centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és a pelletet újraszuszpendáltuk. 10% FBS-t tartalmazó RPMI-ben. Az izolált sejtek (stromális vaszkuláris frakció, SVF) immunsejtekből, vaszkuláris sejtekből és más stromális sejtekből álltak.

A splenocyták izolálása.

A lépet 70 µm-es hálón keresztül 10 ml mosópufferben préseltük a szövet szétválasztásához. Ezt a lépsejteket tartalmazó oldatot ezután a fent leírt körülmények között centrifugáltuk, hogy a sejteket a lépszövetből összegyűjtsük. A vörösvértestek lizálásához ebben a nagyobb mintában 5 ml ACK lizáló puffert használtunk, és a reakciót 5 perc után leállítottuk 10 ml mosóközeg hozzáadásával. Az immunsejteket összegyűjtöttük és 10% FBS-t tartalmazó RPMI pufferben szuszpendáltuk a fentiek szerint.

Sejtfestés.

Áramlási citometria.

A mintákat 4 színű áramlási citométerrel elemeztük. Ezután specifikus kapukat állítottak be az áramlási citométeren 500 000 esemény összegyűjtésére. Az összegyűjtött adatokat vizualizálták és elemezték a FlowJo szoftver segítségével.

EREDMÉNYEK.

Az antitestkeverék hatékonyan lehetővé teszi az áramlási citometriát a myeloid vonal sejtjeinek azonosítására.

A sejtoldatokat preparatív áramlási citométerbe juttattuk, hogy mikroszkóppal izolálhassuk a szétválasztott sejt-alcsoportokat. A mieloid sejteket a limfoid sejtektől sikeresen elválasztva láthatjuk az 1. kiegészítő ábrán. A sejtképek hasonló méretűek voltak, és csak a mag alakjában változtak. Kisebb sejtek jelenléte azt sugallta, hogy az áramlási citométer nem izolálta hatékonyan a mieloid sejteket a limfoid sejtektől.

Áramlási citometria Kapu Ly6c magas pro-gyulladásos monociták esetén.

A lépszöveteknél kisebb mértékben csökkent a monociták, a makrofágok, a dendritikus sejtek száma, amikor kizárólag a myeloid és lymphoid sejteket választották szét, az 1. ábrán látható módon. Az áramlási citométer első kapujába esett myeloid sejtek százalékos aránya a sovány egér 0,862%, az elhízott egereké pedig 0,722%. Az áramlási citométertől kapott százalék a kapu területén belül megszámlált összes sejt száma az ezen a parcellán lévő összes sejt számához viszonyítva.

1.ábra. A lép makrofágok, monociták és dendritikus sejtek gyakorisága összehasonlítható sovány és elhízott egerekben. Az egereket HFD-vel vagy LFD-vel etettük, és 12 hét elteltével a lépeket összegyűjtöttük, és áramlási citometriával elemeztük a makrofágokat, monocitákat és dendritikus sejteket. A makrofágok, monociták és dendritikus sejtek (CD11b + CD90- B220- NK1.1-, Ly6G-, Siglec F-) gyakoriságát kék színnel jelöltük.

Ha azonban a makrofágokat és a dendritikus sejteket elválasztjuk a gyulladásgátló monocitáktól, akkor a gyulladásgátló monociták százalékos arányának 15,1% -os növekedését tapasztaltuk, ha elhízott környezetben a 2. ábra mutatja.

2. ábra. A lép elhízott környezete növelte a pro-gyulladásos monociták prevalenciáját. Noha az eseményszám meghatározta, hogy a sovány egér parcelláján közel 2000 további sejt található, az elhízott egerek sejtjeinek nagyobb százaléka található meg a Ly6c magas monocita kapun belül.

A fehér zsírszövetben a monociták, a makrofágok és a dendritikus sejtek aránya nyilvánvalóan (16,62%) nő. (3. ábra). Az elhízott ábra azt mutatja, hogy a kisebb sejtszám ellenére még mindig nagyobb a makrofágok, a monocita és a dendritikus sejtek aránya, mint a sovány egérsejtek.

3. ábra. A zsírszövet a makrofágok, a monociták és a dendritikus sejtek fokozott előfordulását mutatta. Volt olyan növekedés, amely jól látható az elhízott ábrán a soványhoz képest. Annak ellenére, hogy több sejtet számláltak a sovány ábrán, az elhízott egereknél még mindig nagyobb volt a mieloid immunsejt kapu.

Ez a növekedés nem mond semmit a zsírszövetben található makrofágok, monociták és dendritikus sejtek teljes számáról. Inkább azt állítja, hogy elhízott egerekben a zsírszövet immunsejtjei nagyobb valószínűséggel makrofágokból, monocitákból és dendritikus sejtekből állnak.

4. ábra. A gyulladásgátló monociták gyakorisága a zsírszöveten belül is látható növekedést mutat. Jelen van a pro-gyulladásos monociták százalékos növekedése, de nem olyan nagy, mint a 4. ábrán. Ezeknek a görbéknek más anomáliája van, ahol az elhízott ábrán megszámlált sejtek száma csaknem 3000-rel több, mint a sovány ábrán.

Azt is megállapították, hogy az elhízott egerekben a zsírszövetben a pro-gyulladásos monociták aránya nőtt a sovány kontrollokhoz képest (4. ábra). A növekedés kevésbé volt szembetűnő, mint a 3. ábrán látható makrofágok, monociták és dendritikus sejtek növekedése, és kisebb volt, mint a 2. ábrán a gyulladásgátló monocita százalékos növekedése a lépszövetekben.

VITA.

Az ebben a vizsgálatban alkalmazott antitest-keverék sikeresen azonosította a különböző típusú immunsejteket, amelyek megtalálhatók akár lép-, akár zsírszövetekben. Ezt úgy határoztuk meg, hogy megnéztük azokat a sejteket, amelyek fluoreszcenciával aktivált sejtválogatáson (FACS) estek át. Az azonosított sejt szubpopulációk morfológiáját nagy teljesítményű mikroszkóppal lehetett megerősíteni (1. kiegészítő ábra). Az egyes kapuk után centrifugált minták szisztematikus megtekintésével az áramlási citometria során fenotípusosan meghatároztuk, hogy az antitestoldat elegendő-e a myeloid sejtek elválasztásához a limfoid immunsejtektől és specifikusan a monocitáknak a makrofágoktól és dendritikus sejtektől. Ezenkívül a monocitákat sikeresen elválasztotta az az intenzitás is, amelyben expresszálták a Ly-6C-t.

A lép áramlási citometriája váratlan volt, mivel feltételezték, hogy az elhízás növeli a mieloid immunsejtek mennyiségét. A fenti eredményeket az irodalom is alátámasztja, mivel a lép a monociták és más immunsejtek tárolója, és a gyulladás során az egész testet elhelyezi [2]. Ez egy lehetséges magyarázat a mieloid immunsejtek százalékos arányának enyhe csökkenésére az 1. ábrán. Annak ellenére, hogy egy korábbi tanulmány kifejezetten a lépben lévő monociták számának drasztikus csökkenését tárgyalta szívizominfarktus vagy szívroham után, alkalmazható ennek a kutatásnak az ellenére, hogy az elhízás gyakrabban krónikus gyulladással társul, és nem a miokardiális infarktus során fellépő akut gyulladással [2]. Bár vannak különbségek az akut gyulladás és a krónikus gyulladás jellemzői között, az a megfigyelés, miszerint a myeloid sejtek százalékos aránya csökkent, ha elhízott környezetben van, jelzi, hogy a gyulladás valamilyen állapota a szervezetben bekövetkezik.

A lépszövet áramlási citometriájának eredményei alapján nem állapítható meg, hogy a lépből az immunsejtek telepítését előidéző gyulladást elhízás okozta-e. A 2. ábrán a mieloid sejtek és különösen a Ly-6C magas gyulladásgátló monociták százalékos növekedése jelzi a zsírszövetben valójában bekövetkező gyulladást, amely lehetséges okokat ad arra, hogy az elhízott egerek lépében miért volt kevesebb a mieloid immunsejtek, ha azokat zsírszövetbe küldték a gyulladás elősegítésére. Mind a 3., mind a 4. ábrán megemelkedett a mieloid sejtek és a pro-gyulladásos monociták százalékos aránya, ami további okokat adott arra, hogy van némi összefüggés az elhízás, a gyulladás és a myelopoiesis között.

Bár megállapították, hogy az elhízás valóban a gyulladásgátló monociták felhalmozódását okozta a zsírszövetben, további munkára van szükség az e mögött meghúzódó mechanizmus meghatározásához. Hasznos lenne megtudni azt is, hogy ez az elhízás okozta krónikus gyulladás végső soron rontja-e az immunsejtek működését és hatékonyságát, hasonlóan egy autoimmun betegséghez. Annak ellenére, hogy további kutatásokra van szükség az elhízás immunrendszerre gyakorolt fiziológiai és biológiai hatásainak további magyarázatához, a projektből származó információk másoknak is utat kínálnak a helyes irányba való lépéshez, amíg az elhízás immunrendszerre gyakorolt hatása meg nem szűnik. teljesen megértette.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.

Szeretnék köszönetet mondani a Vanderbilt-i Természettudományi és Matematikai Iskolának, hogy lehetőséget biztosítottam arra, hogy ezen a nyáron kutatást végezhessek a Vanderbiltnél. Szeretném továbbá elismerni a Van Kaer laboratóriumot, amely a kutatásom elvégzéséhez szükséges összes erőforrást rendelkezésre bocsátotta. A legfontosabb, hogy szeretnék köszönetet mondani mentoromnak, Dr. Wu-nak, aki megtanított minden szükséges készséget a projekt megvalósításához, mindig válaszolt számtalan kérdésemre, és rendíthetetlen támogatásáért. Ezúton is szeretnék köszönetet mondani Dr. Eedsnek minden támogatásáért és segítségéért, amikor kutatásaimat különféle tudományos irodákhoz küldtem.