Az elhízás megváltoztatja a mikrobiális közösség profilját a koreai serdülőknél

Egyformán hozzájárult ehhez a munkához: Hae-Jin Hu, Sin-Gi Park

Társulás TheragenEtex Bio Institute Inc., Suwon, Koreai Köztársaság

Egyformán hozzájárult ehhez a munkához: Hae-Jin Hu, Sin-Gi Park

Társulás TheragenEtex Bio Institute Inc., Suwon, Koreai Köztársaság

Orvosbiológiai Tudományok Központja, Koreai Egészségügyi Intézet, Cheongju, Chungcheongbuk-do, Koreai Köztársaság

Hallym Egyetem Szent Szív Kórház Családorvosi Osztálya, Hallym Egyetem, Gangnam, Szöul, Koreai Köztársaság

Hallym Egyetem Szent Szív Kórház Családorvosi Osztálya, Hallym Egyetem, Anyang, Gyeonggi-do, Koreai Köztársaság

Családorvosi osztály, Elhízáskutató Intézet, Seoul Paik Kórház, Orvostudományi Főiskola, Inje Egyetem, Szöul, Koreai Köztársaság

Orvosbiológiai Tudományok Központja, Koreai Egészségügyi Intézet, Cheongju, Chungcheongbuk-do, Koreai Köztársaság

Enterális betegségek tagsági osztálya, Fertőző Betegségek Központja, Koreai Nemzeti Egészségügyi Intézet, Heungdeok-Gu, Cheongju, Koreai Köztársaság

Hae-Jin Hu,
Sin-Gi Park,
Han Byul Jang,
Min-Gyu Choi,
Kyung-Hee park,
Jae Heon Kang,
Sang Ick Park,
Hye-Ja Lee,
Seung-Hak Cho

Javítás

2015. szeptember 4 .: Hu HJ, Park SG, Jang HB, Choi MK, Park KH és mtsai. (2015) Javítás: Az elhízás megváltoztatja a mikrobiális közösség profilját a koreai serdülőknél. PLOS ONE 10 (9): e0138015. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138015 Nézet javítása

Ábrák

Absztrakt

Biokémiai elemzések

Vacutainer csövet használtunk vérminták gyűjtésére az antecubitalis vénából 9:00 és 11:00 között 12 órás éjszakai böjt után. 30 percen belül a plazmát és a szérumot elválasztották és -80 ° C-on tárolták a további elemzés előtt. A trigliceridek (TG), az összes koleszterin (Tchol), a nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin (HDL-C), a hs-crp és a glükóz szintjét autoanalizátorral (7600II modell; Hitachi, Tokió, Japán) mértük.

Székletmintavétel és DNS-kivonás

Mintákat vett minden résztvevő otthon. Egy friss székletminta (

30 ml) száraz jéggel ellátott gyűjtőedénybe helyeztük, és 12 órán belül a vizsgálati központba vittük. A mintát a DNS-extrakció előtt -70 ° C-on tároltuk a laboratóriumban. A DNS-t QIAamp DNS székletkészlettel (Qiagen, Valencia, Kalifornia) extraháltuk a gyártói protokoll szerint. A DNS minőségét és koncentrációját Nanodrop 2000 spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) ellenőriztük.

A 16S rRNS piroszekvenálása

A kivont DNS-ből a 16S rRNS génfragmenseket amplifikáltuk. A következő vonalkódolt primereket terveztük a hiper-variábilis régiók (V1-V3) megcélzásához a 16S rRNS-génen belül: 9F (5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-A GAGTTTGATCMTGGCTCAG -3 '[baktériumok 16rRNS-alapozója 90%] '-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC- GGGTTCGATTCTGGCTCAG -3' [Bifidobacterium 16 rRNS primer 10% -ot tartalmazott; a célrégió primerek alá vannak húzva) és 541R (5'-CCATCTCATCCCTGTGCGTGCGTGTGCGTGCGTGCGTGCGTGTGCGTGCGTGTGCGTGT 'az egyes vonalak egyedi vonalkódját jelöli) (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-61493/protocols/). A PCR-t a következőképpen hajtottuk végre: kezdeti denaturálás 95 ° C-on 5 percig, majd 30 ciklus denaturálás 95 ° C-on 30 mp-ig, láncindító lágyítás 55 ° C-on 30 mp-ig, és meghosszabbítás 72 ° C-on 30 mp-ig, végső megnyúlással 72 ° C-on 5 percig. Mindegyik mintát három külön-külön PCR-nek vetettük alá.

A PCR termék minőségét egy minta 2% -os agaróz gélben történő futtatásával, majd a Gel Doc rendszerrel történő megjelenítéssel (BioRad, Hercules, CA, USA) igazoltuk. Az amplifikált termékeket QIAquick PCR tisztító készlettel (Qiagen, Valencia, CA, USA) tisztítottuk, és azonos mennyiségeket egyesítettünk. A rövid DNS-fragmenseket (nem megcélzott termékeket) eltávolítottuk Ampure gyöngyökkel (Agencourt Bioscience, MA, USA). A termékek minőségét és méretét egy Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, Kalifornia, USA) és egy DNS 7500 chip segítségével értékeltük. Az emulziós PCR-hez kevert amplikonokat használtunk, amelyeket Picotiter lemezekre helyeztünk. A szekvenálást a GS Junior szekvenáló rendszerrel (Roche, Branford, CT, USA) végeztük a gyártó utasításai szerint.

A piroszekvenálási adatok elemzése

A piroszekvenálási adatokat a korábban leírtak szerint elemeztük [21–23]. Az olvasásokat az egyes PCR-termékek egyedi vonalkódjaival rendeztük. Ezután a vonalkód-, linker- és primer-szekvenciákat eltávolítottuk az eredeti szekvenálási leolvasásokból. Bármely olvasmány, amely két vagy több kétértelmű nukleotidot tartalmaz, alacsony minőségű pontszámúak (átlagos pontszám (1), ahol m a célcsoportok száma, Ntotal pedig a példák teljes száma, amelyek megfelelnek a szabályoknak (az As összes száma A szabályban A → B). Ng a jósolt g célcsoportba tartozó példák száma.

statisztikai elemzések

Az összes minta mikrobiális sokfélesége

A primer szekvenciák, valamint a gyenge minőségű és kiméra szekvenciák kiszűrése után 134 mintából összesen 1 185 358 kiváló minőségű szekvenciát (olvasás) (tartomány, 2 065–42 522 olvasás) kaptunk (az S1 File A ábrájának A része). Mindegyik mintára átlagosan 8846 olvasás terjedt ki, ami hasonló a 20 koreai egyed bélmikrobiotáját vizsgáló tanulmányban közölt átlagos olvasások számához (8427 olvasás) [16]. Ezen olvasatok alapján kiszámoltuk az OTU-k számát a bél mikrobiota sokféleségének vizsgálatához. Az OTU-k átlagos száma 356 ± 140 (tartomány, 105–876) volt (az S1 fájlban az A. ábra B része). A normál és elhízott egyének között nem volt szignifikáns különbség az OTU-k számában (Mann-Whitney U-teszt, p = 0,072). Ezenkívül nem találtunk nyilvánvaló különbséget az alfa diverzitás (Shannon index) értékeiben a normális és elhízott minták között (az OTU-k átlagos száma: normális 6,94 ± 0,49; elhízott 6,98 ± 0,59) (B ábra az S1 fájlban). Ezenkívül a béta változatosság PCA eredménye nem mutatott különbséget a normál és az elhízott minták között (C ábra az S1 fájlban).

A széklet mikrobiális összetételének összehasonlítása

A fánk-parcellák legbelső gyűrűje normál és elhízott egyének számára egyaránt megmutatja az összetételt a törzs szintjén, míg a középső és a legkülső gyűrű a család és a nemzetség szintjét mutatja. Jelentős különbség mutatkozott a Bacteroides és a Prevotella átlagos arányában a normális és az elhízott minták között a nemzetség szintjén. Ez a tendencia családi szinten is fennmaradt. Azonban normális és elhízott serdülők mintáiban a menekültügyi szinten nem voltak szignifikáns különbségek a Bacteroidetes, Firmicutes és Proteobacteria populációkban. Minden olyan mikrobiota látható, amely> 1% (átlagérték) összetételt képvisel.

A. Nemzetségszint és B. Családi szint.

A. Boxdiagramok, amelyek a Bacteroidetes, Firmicutes és Proteobacteria populációk hasonló bőségét mutatják normál és elhízott serdülőknél. B. A Firmicutes/Bacteroidetes arány a normál és elhízott serdülők bélében. A normális és elhízott serdülők között nem volt szignifikáns különbség az F/B arányban.

Ezután az F/B arányt vizsgáltuk, amelynek kapcsolata az emberi elhízással nem tisztázott [17–19]. Nem találtunk szignifikáns különbséget az F/B arányban a normális és elhízott serdülők között (F/B arány ± SD: F/B normális = 0,50 ± 0,53; F/B elhízott = 0,56 ± 0,86; p = 0,384) (3B ábra).

A nem parametrikus Mann-Whitney U teszt más baktérium taxonokat is azonosított, amelyek összetételükben jelentősen különböztek az elhízott és a normál minták között. Jelentős különbségeket találtunk az Alistipes, a Faecalibacterium és az Oscillibacter populációkban a nemzetség szintjén (FDR-korrigált p = 0,0125, 0,0420 és 0,0007) (2. táblázat), valamint a Rikenellaceae, a Sutterellaceae, a Ruminococcaceae és a Veillonellaceae populációban a családi szint (FDR-korrigált p = 0,0112, 0,0450, 0,0022 és 0,0450) (3. táblázat).

Társulás a BMI és a biokémiai markerek között

Ezután mértük a korrelációt a nemzetségi taxonok alapján (az öt taxon alapján statisztikailag szignifikáns különbségeket mutatunk az elhízott és normális serdülők között a nemzetség szintjén) és a BMI z-pontszám vagy a biokémiai markerek szintje között (4. táblázat). A korábbi megfigyelésekkel összhangban megállapítottuk, hogy a Bacteroides és Prevotella populációk szignifikánsan összefüggésben álltak a BMI z-pontszámával (p. 4. táblázat. A bél mikrobiota összetétele és a testtömeg-index (BMI) z-score és a biokémiai markerek közötti összefüggés Pearson r (p-értéke).

A TG, a Tchol és a hs-crp negatív korrelációt mutatott a Bacteroides arányával (p = 0,0049, 0,0023 és 0,0038), míg a HDLc pozitív korrelációt mutatott (p = 0,0165). Ezzel szemben a TG és a hs-crp pozitív korrelációt mutatott a Prevotella populációval (p = 0,0394, illetve 0,0150). Az Oscillibacter populáció negatív korrelációt mutatott a hs-crp-vel, bár kevésbé szignifikáns (p = 0,0360).

Egyesületi szabálybányászat

Vita

Itt 67 elhízott és 67 normál koreai serdülő székletmintáit vizsgáltuk, hogy meghatározzuk a bél mikrobiota összetétele és a gyermekkori elhízás összefüggését. A QIAamp DNS székletkészletet használtuk a DNS kinyerésére, mert ez a készlet nagy hatékonyságot mutat, ha különböző protokollokkal használjuk [31, 32]. Egy tanulmány, amely összehasonlította a DNS-extrakció mechanikai és enzimatikus módszereit, azt mutatta, hogy a mechanikus sejtbontás magasabb baktériumok sokféleségét eredményezi és javítja a DNS-extrakció hatékonyságát [33]. A mikrobiota azonban az alkalmazott extrakciós módszertől függetlenül nagyon hasonló volt.

Megállapítottuk, hogy a normál serdülőktől származó mintákban a mikrobiota összetétele megegyezett azzal a vizsgálattal, amely 20 koreai személy bélmikrobiotáját vizsgálta a menekültügyi szinten [16], valamint egy olyan tanulmányban, amely a koreai monozigóta ikrek bél enterotípusait vizsgálta. [34]. Annak ellenére, hogy a 20 koreai minta közül kettő gyermekektől származik, feltételezhetjük, hogy a normál koreai serdülőknek és felnőtteknek hasonló a bél mikrobiális összetétele, legalábbis a menekültügyi szinten. A koreai monozigóta ikrek vizsgálatának eredményei azt mutatták, hogy az egészséges koreaiak mikrobiotája két enterotípusba csoportosult, amelyekben vagy a Bacteroides, vagy a Prevotella dominál. Ezek az enterotípusok azonban nem voltak szignifikáns összefüggésben az olyan biomarkerekkel, mint az életkor, a BMI, a vérnyomás, a Tchol vagy a TG. Csak egy biomarker, a szérum húgysav különbözött a két enterotípus között [34].

Számos tanulmány megkísérelte a bél mikrobiota összetétele és az elhízás közötti összefüggést azonosítani [7–11, 35]. Egyes eredmények következetesek, míg mások ellentmondásosak. Például nem találtunk szignifikáns különbséget az elhízott és normális serdülők közötti F/B arányban, ami összhangban áll Karlsson és munkatársai [17] tanulmányával, amely ezt az arányt kövér és sovány svéd óvodáskorú gyermekeknél vizsgálta. Ezzel szemben egy spanyol tanulmány [19] és egy belga tanulmány [18] az elhízott gyermekeknél megnövekedett F/B arányról számolt be. Figyelembe véve, hogy a bél mikrobiota összetétele és az elhízás közötti összefüggés kor és földrajzi elhelyezkedés szerint eltérő lehet [13–16], feltételezhetjük, hogy e vizsgálatok eredményei csak meghatározott populációkra és meghatározott korcsoportokra vonatkozhatnak. Feltételezzük, hogy az inkonzisztenciák a genetikai, környezeti, technikai és/vagy klinikai tényezők közötti összetett összefüggéseknek köszönhetők. Ezért integratívabb megközelítésekre lesz szükség, ha teljes mértékben meg akarjuk érteni ezt a komplex összefüggést.

Megállapítottuk azt is, hogy a Bacteroides populáció mérete negatívan társult a TG, Tchol és hs-crp szintekhez (p = 0,0049, 0,0023 és 0,0038), de pozitívan társult a HDLc-hez (p = 0,0165); ezek az eredmények azonban nem egyeznek Bervoets és munkatársai eredményeivel, akik 26 elhízott és 27 sovány, 6–16 éves gyermeknél vizsgálták a bél mikrobiotájának összetételét [18]. Nem találtak szignifikáns összefüggést a Bacteroides populáció és a biokémiai markerek, például glükóz, HDLc vagy Tchol között; azonban pozitív összefüggést találtak a Lactobacillus és a plazma hs-CRP szintje között (p = 0,007). Nem világos, hogy a vizsgálatuk és a saját eredményeink közötti különbség a kisebb mintanagyság vagy a populációbeli különbségek következménye.

A legújabb tanulmányok a baktériumok összetétele és az étrend összefüggését vizsgálták. De Filippo és mtsai. kimutatta, hogy az afrikai vidéki gyermekek székletközösségei különböznek az európai gyermekekétől [15]. Azok az afrikai gyermekek, akik alacsony zsír- és fehérjetartalmú étrendet fogyasztanak, és növényi eredetű ételekben gazdagok, jelentősen gazdagabb Bacteroidetes populációval és kimerült Firmicutes populációval rendelkeznek, összehasonlítva az európai gyermekekkel. Más tanulmányok azt is bizonyítják, hogy a Prevotella-val dúsított enterotípus magas szénhidráttartalmú étrendhez kapcsolódik [18, 40], míg a Bacteroides-dúsított enterotípus összefüggésben van a magas fehérje- és állati zsírtartalmú étrenddel [41]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az étrend megváltoztatása megváltoztatja a bél mikrobiotáját. Annak ellenére, hogy a jelenlegi tanulmányban nem tudtuk értékelni az étrendi minta és a bél mikrobiális összetételének az elhízásra gyakorolt hatását, úgy gondoljuk, hogy ezt a jövőbeni mélyreható vizsgálatok során figyelembe kell venni. Ezenkívül a jelen tanulmány keresztmetszeti kialakítású volt. Ezért további prospektív vizsgálatokra van szükség a bél mikrobiota, az étrend és az elhízás közötti okozati összefüggések teljes meghatározásához.

segítő információ

S1 fájl.

A ábra, Szekvenálási leolvasások és működési taxonómiai egységek (OTU-k) száma. A. Minta/olvasás száma. B. OTU-k száma mintánként. B. ábra: Az operatív taxonómiai egységek alfa sokfélesége (Shannon-index). Shannon-index minden mintához. C ábra, Béta változatosság főkomponens elemzés diagram normál és elhízott egyének számára. A. táblázat: Az asszociációs szabályok bányászatával létrehozott társulási szabályok 28 különböző nemzetség felhasználásával.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: SHC HJL. Végezte a kísérleteket: MGC KHP JHK. Elemezte az adatokat: SHC HJH SGP. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: SHC HBJ SIP. Írta az írást: SHC HJH.