Differenciális fehérje expresszió fehér zsírszövetben az elhízásra hajlamos és elhízásnak ellenálló egerekből a magas zsírtartalmú étrend és az elhízás elleni növényi gyógyszerek hatására

Dr. Jong Won Yun és Dr. Myung-Sook Choi,

elhízásra

Biotechnológiai Tanszék, Daegu Egyetem, Kyungsan, Kyungbuk 712-714

(Koreai Köztársaság); és az Élelmezés- és Táplálkozásgenomikai Kutatóközpont,

Élelmiszertudományi és táplálkozási tanszék, Kyungpook Nemzeti Egyetem, Daegu

702–701 (Koreai Köztársaság); E-mail [email protected], e-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízás egy multifaktoriális rendellenesség, amelyet genetikai és környezeti tényezők egyaránt befolyásolnak, ami fizikai és külső szövődményekhez, valamint különböző betegségek, például kardiovaszkuláris kockázatok, magas vérnyomás, diszlipidémia, endotheliális diszfunkció és 2-es típusú diabetes mellitus előrehaladásához vezet [1,2, 3].

A súlygyarapodásra való hajlam jelentősen változhat az egyéneknél a külső hatások, például a túlzott energiafogyasztás és az alacsony fizikai aktivitás miatt [4,5,6]. Az elhízás kialakulásában azonban nagy az egyének közötti különbség a hasonló körülményeknek való kitettség ellenére. Például egyesek könnyen meg tudnak hízni és elhízni (elhízásra hajlamos, OP), míg mások nem (elhízásra ellenállóak, OR) [7]. Azonban ezek a fenotípusos különbségekért felelős utak még mindig nagyrészt ismeretlenek [8].

Manapság az elhízás megelőzése és kezelése jelentős közegészségügyi kihívás, és már nem tekinthető csak kozmetikai problémának. Bár a fogyás és a testsúlykontroll gyógyszerek gyakoriak, orvosi hatásuk korántsem kielégítő, mivel sok gyógyszer nem kívánt mellékhatással jár [9]. A jelenleg rendelkezésre álló nyugati orvosi kezelések miatti aggodalmak miatt egyesek az elhízás terápiás kezelésére irányuló alternatív gyógyszerek iránti érdeklődés felé fordultak [10,11,12].

Annak a marker molekulának a felfedezéséhez, amely hasznos lehet az elhízás iránti fogékonyság hátterében álló mechanizmusok tisztázásában, különféle állati szöveteket vizsgáltak, és azok teljes proteomjait elemezték a fehérje funkcióinak és poszttranszlációs módosításainak jellemzése céljából [24,25]. A fehérjék szétválasztása, azonosítása és jellemzése, valamint kölcsönhatásuk más fehérjékkel a proteomanalízis alapvető célja. A kétdimenziós elektroforézist (2-DE) a MALDI-TOF-MS-szel kombinálva hatékony eszköznek tekintik több ezer zsírszöveti fehérje szétválasztásában [26,27]. Ez a megközelítés lehetővé teszi a normál és a betegségminták összehasonlítását, amelyek különböző módon expresszált fehérjéket tárnak fel.

A zsírszöveti fehérjék elhízással kapcsolatos tényezői fő szerepet játszanak a metabolikus rendellenességek kialakulásában [26,28]. A zsírszövet aktív endokrin szervként működik, amely kiválasztja az adipokineket, hozzájárulva az olyan fiziológiai folyamatok szabályozásához, mint az energia homeosztázis, a szaporodás és a gyulladás. Számos génprofilozáson alapuló tanulmány a súlycsökkenés utáni WAT újraprogramozásra összpontosított [29,30]. Bár a DNS tömb hatékony eszköz erre a célra, az mRNS expressziójának prediktív értéke korlátozott a sejtfiziológiához képest. Az mRNS expressziós szintje gyakran nem párhuzamos egy adott gén fehérje expressziójának szintjével [31,32]. Továbbá, a fehérjeforgalom és a transzláció utáni módosítások, amelyek elengedhetetlenek a sejtek viselkedéséhez, nem tartoznak a DNS-adatokból nyert információk körébe [33]. Következésképpen az étrend WAT-ra gyakorolt ​​hatásainak tágabb megértése megköveteli a fehérje expresszió és funkció független vizsgálatát az mRNS expressziós elemzésekkel együtt.

Jelen tanulmányunkban a hagyományos természetes növényi gyógyszerek elhízásellenes hatásait vizsgáltuk azon képességük alapján, hogy megváltoztathatják-e a WAT ​​fehérjék expresszióját a HFD által kiváltott elhízott egerekben. Legjobb tudomásunk szerint ez az első proteomikai tanulmány, amely a hagyományos növényi gyógyszerekkel végzett WAT fehérje moduláció profilozását végzi elhízott állatmodellben.

Anyagok és metódusok

Állatok és tenyésztési feltételek

Asztal 1

A normál étrend (ND), a magas zsírtartalmú étrend (HFD) és a magas zsírtartalmú étrend összetétele Taeumjowi-tang-nal (TH)

Fehérje minták előkészítése

A WAT-ot kivágtuk az egerekből, közvetlenül egy éjszakai éheztetés után, dietil-éterrel végzett érzéstelenítést követően. A kapott szöveteket ezután hideg sóoldattal mossuk, folyékony nitrogén alatt porítjuk és -80 ° C-on tároljuk. A szöveteket 200 ml rehidrációs pufferoldatban lizáltuk, amely 7 M karbamidot, 2 M tiokarbamidot, 4% CHAPS-ot, 20 mM DTT-t, 1 mM PMSF-t, 2% IPG-puffert (Ampholyte 3/10, Bio-Rad) és nyomokban bróm-fenolt tartalmazott. kék. A lizált szöveteket ezután homogenizátorral (PT 1200E, Kinematica, Luzern, Svájc) jégen homogenizáltuk, majd a homogenizált WAT szövetek kivonatait 13 000 ×g 20 percig. A felülúszót ezután -80 ° C-on tároltuk az elemzésig. A teljes WAT szövet fehérjetartalmát RC DC ™ protein assay (Bio-Rad) alkalmazásával határoztuk meg.

Kétdimenziós elektroforézis (2-DE)

Képszerzés és adatelemzés

A géleket egy UMAX PowerLook 1120-on (Maxium Technologies, Akron, OH, USA) készítettük, és a képek összehasonlításához módosított ImageMaster 2-D szoftvert V4.95 (GE Healthcare) használtunk. A normál csoport géljeiből kiválasztottunk egy referencia gélt, és a többi gélből észlelt foltokat összeillesztettük a referencia gélben levőkkel. A relatív optikai sűrűséget és a relatív térfogatot kiszámítottuk a gélfestésbeli különbségek korrigálása érdekében. Az egyes foltintenzitási térfogatokat háttér-kivonással és a teljes folttérfogat normalizálásával dolgoztuk fel, és az így kapott foltmennyiség-százalékot használtuk összehasonlításra.

Fehérje azonosítás

A PMF segítségével történő fehérje-azonosításhoz a fehérjefoltokat kivágtuk, tripszinnel (Promega, Madison, WI, USA) emésztettük, CHCA-val kevertük 50% ACN/0,1% TFA-ban és MALDI-TOF elemzésnek vetettük alá (Microflex LRF 20, Bruker Daltonics ). A spektrumokat spektrumonként 300 felvételből gyűjtöttük 600-3000 m/z tartományban, és kétpontos belső kalibrációval kalibráltuk tripszin automatikus emésztési csúcsok alkalmazásával (m/z 842.5099, 2211.1046). A csúcslista a Flex Analysis (3.0 verzió) segítségével készült. A csúcsok kiválasztásához használt küszöbérték a következő volt: a monoizotópos tömeg minimális felbontása esetén 500, az S/N esetében 5,0. A peptidtömegeket az összes fehérje elméleti peptidjeihez illesztettük az NCBI adatbázisban a Matrixscience által kifejlesztett MASCOT segítségével (http://www.matrixscience.com). A következő paramétereket használtuk az adatbázis kereséshez: a tripszint, mint hasító enzimet, legfeljebb egy elmaradt hasítást, a jód-acetamidot (Cys), mint teljes módosítást, az oxidációt (Met), mint részleges módosítást, monoizotópos tömegeket és tömegtűrést ± 0,1 Da. A fehérje pontszám -10 * Log (o), hol o annak a valószínűsége, hogy a megfigyelt mérkőzés véletlenszerű esemény, és 61-nél nagyobb szignifikáns (o a F, szekvencia érzéki szálakból; b R, szekvencia antiszensz szálakból

Statisztikai analízis

Az összes kísérleti eredményt egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze a Social Science Statistics Package (SPSS, 14.0k verzió) programmal; az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Védett legkevésbé szignifikáns különbség (LSD) tesztet, amely az egyirányú ANOVA-ban végzett egylépéses eljárásokból álló többszörös összehasonlítás módszere, az átlagok közötti jelentős különbségek kimutatására használták (o egy NCBInr/SWISS adatbázis hozzáférési szám. b A névleges tömeg egy elem leggyakrabban előforduló, természetes stabil izotópjának egész tömege. c MASCOT valószínűségen alapuló molekulatömeg-keresési pontszám PMF-re számítva. A fehérje pontszám: - 10 x log (P), hol P annak a valószínűsége, hogy a megfigyelt mérkőzés véletlenszerű esemény; a MASCOT kereső programot használó NCBInr adatbázison alapszik, mivel az MS/MS adatok és a> 61-es fehérjepontszám szignifikáns (P d ND azt jelenti, hogy nem észlelték. A Spot Id azonos számok a 2. ábra gélképén

2. ábra

Reprezentatív ezüsttel festett 2-DE gélképek egerek WAT proteomjáról. (A) Felfelé szabályozott és (B) lefelé szabályozott fehérjék OP egerekben az ND-vel táplált egerekhez képest. A differenciálisan szabályozott fehérjéket és az érdekes fehérjéket körökkel és nyilakkal jelöljük. A gélben lévő számokat a 3. táblázat tartalmazza.

Az elhízással kapcsolatos fehérjék differenciális expressziója WAT-ban

Az OP és OR egerek közötti, differenciálisan megváltozott fehérjék összehasonlítása előtt először a WAT ​​fehérje szintet hasonlítottuk össze az ND, OP és OR egerek között. A legtöbb azonosított fehérje szignifikánsan megváltoztatta a fehérje expresszióját az OP és az ND-vel táplált egerek között a TH kezelésre adott válaszként, míg 45 fehérje hasonló szintet mutatott az OR egerekben (3. ábra). Összesen 26 fehérjét szabályoztak felfelé OP egerekben, miközben alacsony szinten tartották ND és OR egerekben. Ezenkívül a WAT-minták elemzése 31 olyan fehérjét azonosított, amelyek HFD-vel táplált OP egerekben, míg normál és OR egerekben alacsonyan voltak szabályozva. Mostanáig ezeknek a fehérjéknek a legtöbbje nem mutatkozott megkülönböztetve WAT-ban a HFD-re adott válaszként. Ezért ezeket a fehérjéket potenciális marker fehérjéknek tekinthetjük az OP és OR egerek közötti WAT fenotípusos különbségek meghatározásához.

3. ábra

Differenciálisan szabályozott fehérjék WAT-ban OP egerekből, összehasonlítva ND/OR/TH egerekkel. (A) Felfelé szabályozott és (B) lefelé szabályozott fehérjék OP egerekben. Minden oszlop átlagos térfogatsűrűséget (%) mutat a 2-DE elemzésben. Az ND és az OP közötti statisztikai jelentőséget egyirányú ANOVA teszttel határoztuk meg, ahol o