Az enyhe tubuláris károsodás kalcium-oxalát-kristályuria-t indukál a finom hiperoxaluria modelljében: Bizonyíték arra, hogy a vese litogeneziséhez szükség van egy második találatra

Absztrakt

Az idiopátiás kalcium nephrolithiasis (ICN) egy multifaktoriális betegség, amely különféle ok-okozati tényezőket foglal magában, amelyek lehetnek étrendi (fehérje, kalcium, nátrium, lipidek stb. Bevitele) (1), környezeti (környezeti és munkahelyi életkörülmények, életmód, nap, vízminőség stb.) (2) és genetikai (3). A kövek táplálkozási és környezeti oka a következő megfigyeléseken alapul: (1) A vesekő betegség a 20. század fordulója előtt nem volt gyakori, de előfordulása folyamatosan nőtt; (2) a kőbetegség gyakoribb a tehetős közösségekben (4), és pozitív összefüggés van az egy főre eső jövedelem és az egy főre eső élelmiszer-ráfordítás között; és (3) számos összefüggést jelentettek az étrendi/környezeti tényezők és a kövek vizelettel kapcsolatos kockázati tényezői között (4–6).

Az ebben a tanulmányban feltárt munkahipotézis szerint a nephrotoxinok (azaz ipari szennyezők) károsítják a vese tubulus epitheliumot (TE), elősegítve a kalcium-oxalát (CaOx) kristályok tapadását, és ezzel elősegítve a kristályretenciót és a litogenezist, és hogy ez egybeeshet rendkívüli mértékben szerény vesekárosodás, amelyet a toxin nagyon alacsony adagolása vált ki, például olyan körülmények között, amelyek hasonlítanak a toxin „normális” környezeti expozíciójára.

Patkánymodellt fejlesztettek ki ennek a hipotézisnek a megvizsgálására, a CaOx kristályogenezis (krónikus hiperoxaluria kiváltásával orális etilén-glikol [EG] beadásával) és az ipari toxinok által kiváltott nephrotoxicitás (HCBD intraperitoneális beadásával) tanulmányozására használt modellek alapján. tipikus nefrotoxin [13]). A HCBD nem pusztán kísérleti nefrotoxin, mert elterjedt a bioszférában, különösen a szennyezett ipari területeken (14–18). A Wistar patkánytörzset választották a modell kifejlesztésére a gyakrabban használt Sprague-Dawley patkány helyett, mert az EG-re ugyanúgy és ugyanolyan érzékenységgel reagál a vesekristályok képződése szempontjából (19), de nekünk jobb volt a vesebetegségek HCBD-re való hajlamának ismerete.

Anyagok és metódusok

Az albínó hím Wistar patkányokat (200 ± 10 g; Harlan, San Pietro al Natisone, UD, Olaszország) műanyag ketrecekbe helyezték, szabályozott hőmérsékleti (20 ° C) és páratartalmi (40–60%) körülmények között, sötét 12 órás fényciklus; szokásos rágcsáló-táplálékkal etették őket (Nuova Zoofarm, Padova, Olaszország), és −7 naptól 0 napig ad libitum engedték inni a csapvizet. Négy különböző csoportba sorolták őket: (1) Az 1. csoport (n = 15) EG-t kapott, (2) A 2. csoport (n = 15) EG-t és HCBD-t kapott 10 mg/testtömeg-kg, (3) 3. csoport (n = 15) 15) kapott EG és HCBD 25 mg/testtömeg-kg, és (4) a 4. csoport (n = 15) kapott EG és HCBD 50 mg/testtömeg-kg.

A vizsgálati ütemtervet az 1. ábra mutatja. Huszonnégy órás kísérleti periódusokat T-vel jelölünk, amelyet egy szám követ, T7-től T21-ig. Minden periódus 13 órakor kezdődött. és 13 órakor fejezte be. a következő nap. A T7 és T14 elején, közvetlenül az előző periódus vizeletgyűjtése után, intraperitoneálisan injektálták a HCBD/kukoricaolajat. A patkányok leölésekor ezt a periódus elején, az előző időszak vizeletgyűjtésének befejezése után tették meg. A vizeletet a megadott periódusok végén, reggel 8 órától 13 óráig gyűjtötték. A T0-nál a patkányokat metabolikus ketrecekben helyezték el a vizeletgyűjtés céljából. Az EG-t orálisan adtuk csapvízben (0,5 térfogat/térfogat%) a T1-ből a kísérlet során 3 hétig; a T7-en és a T14-en HCBD-t (tisztaság> 97%; Fluka, Buchs, Svájc) intraperitoneálisan adtunk a patkányoknak a 2., 3. és 4. csoportban; a HCBD-t kukoricaolajban oldottuk (5 ml/testtömeg-kg). Az 1. csoportba tartozó patkányoknak csak kukoricaolajat adtak. A patkányokat dietil-éteres érzéstelenítésben, T8-on (3 patkány/csoport), T10 (3 patkány/csoport), T15 (3 patkány/csoport) és T21 (az összes többi patkány) elpusztítottuk.

Kísérleti tervezés (a részletekért lásd a szöveget).

A T6-tól a vizsgálat végéig a patkányokat egyedi metabolikus ketrecekben helyezték el. Öt órás ürített vizeletmintákat gyűjtöttünk a T0, T6, T7, T8, T9, T10, T11, T13, T14, T15, T16, T17, T18 és T20 készülékeken. Mivel kiváló összefüggést találtunk mind a vizelet kalciumának, mind az oxalátnak, a 24 órás (μmol/24 órában kifejezett) és az 5 órás reggeli gyűjtések (μmol/mmol kreatininban kifejezve; calciuria P 2 (morfometrikus elemzés) Image Pro-Plus 5.1; Media Cybernetics, Silver Spring, MD) alkalmazásával. A transzmissziós elektronmikroszkópiához (TEM) ultravékony metszeteket vágtunk az Epon-beágyazott szövetblokkokból, uranil-acetáttal, majd ólom-citráttal ellenfestve, majd egy Hitachi H-700 elektronmikroszkóp.

Statisztikai elemzések

Az adatok statisztikai elemzése egyirányú ANOVA-t és Bonferroni-korrekciót jelentett a csoportok összehasonlításához és ANOVA-t ismételt mérésekhez.

Eredmények

Tanulmányok a vizeletről

Az EG 0,5% -os orális beadása nem okozott szignifikáns CaOx kristályuria-t a vizsgálat 3 hetes periódusában T1-től T20-ig (1. csoport), de az oxaluriát 200 μmol/mmol kreatininig emelte (1. táblázat). A T6-nál az oxaluria a négy kísérleti ágban szignifikánsan magasabb volt, mint a kiindulási értéknél (T0; P = 0,001 - 0,000), és ezután stabil maradt T20-ig (1. táblázat). A vizsgálat során a négy kísérleti csoport között nem volt statisztikailag szignifikáns különbség az oxaluria között, a T6-tól a T20-ig. A 0,5% EG-vel végzett kezelés (1. csoport) szintén nem okozott statisztikailag szignifikáns variációt a proteinuria és az enzymuria során a vizsgálat során (2. ábra).

A fehérje (A) és az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) és az N-acetil-β-glükózaminidáz (NAG; B) vizelettel történő kiválasztása etilén-glikolt (EG) fogyasztó patkányokban végzett hexaklór-1: 3-butadién (HCBD) beadása után. A vizeletfehérje (U.prot), a vizelet ACE (U.ACE) és a vizelet NAG (U.NAG) az 1. csoportba tartozó patkányokban, amelyek csak EG-t kaptak, a normál tartományban voltak. Az A diagram a T6, T7 (első HCBD injekció), T8 és T9 adatait mutatja. A B ábrán látható ábrák a T7-nél mutatják az adatokat. A T13 és T16 közötti időszak hasonló értéke egybeesik a második HCBD beadással (T14). Az értékeket átlagként és SEM-ként fejezzük ki. * Az alapvonaltól jelentősen eltérő értékek.

A vizelet pH-értéke, oxalát és kalcium kiválasztása a T0, T6, T13 és T20 értékeknél a

Patkányokban, akik EG-t kaptak, a 10 mg/testtömeg-kg HCBD mindkét injekció után (1. csoport) nem okozott kóros proteinuriát vagy NAG enzimuriát, hanem csak szerény ACE enzimuriát (2B. Ábra). Nagyobb dózisoknál (25, illetve 50 mg/testtömeg-kg, 3., illetve 4. csoport), átmeneti, dózisfüggő proteinuria-emelkedést okozott mindkét injekció után (amely 3 d alatt visszafejlődött); az ACE vizeletürítésének átmeneti, dózisfüggő növekedése; és a NAG kiválasztódásának átmeneti növekedése (a legnagyobb dózisnál 50 mg/testtömeg-kg; 2. ábra).

A calciuria és a vizelet pH-ját egyik kezelés sem befolyásolta, és a vizsgálat során a T0-tól a T20-ig állandó maradt (1. táblázat). A főként CaOx-dihidrátból álló kristályuria minden HCBD beadás után az első 24 órában a 2., 3. és 4. csoport összes patkányában megjelent, és a következő 3-4 napon belül fokozatosan elhalványult (2. és 3. táblázat).

CaOx kristályuria a

Patkányok CaOx kristályuriával a

Előzetes kísérletek során két HCBD injekció (10, 25 és 50 mg/testtömeg-kg) 7 napra külön-külön, egyidejű EG-beadás nélkül nem volt képes kiváltani kristályuria-t, de a legmagasabb dózisoknál (25 és 50 mg/testtömeg-kg), mindkét injekció után nagyjából ugyanazokat a változásokat okozták a proteinuriában és az enzimuriában, mint a 3. és 4. csoportban (3. ábra). Az oxaluria, a calciuria és a vizelet pH-ja nem változott.

A fehérje (A), valamint az ACE és a NAG (B) vizelettel történő kiválasztása HCBD beadása után patkányokban, amelyek nem fogyasztottak EG-t. Ezek az adatok egy előzetes vizsgálatból származnak, amelyet csoportonként 10 állat kísérleti körülményeinek felállítása céljából végeztek.

Morfológiai vizsgálat

Csak EG-vel kezelt patkányokban (1. csoport) a T8, T10, T15 és T21 d-nél eltávolított vesék fény- és polarizált fénymikroszkópiája és TEM-je nem mutatott ki szignifikáns morfológiai rendellenességet vagy kristálylerakódást. Ezenkívül a TUNEL festéssel mért apoptotikus index nem volt releváns bármely időpontban.

Kromatin kondenzációjú atommagok a proximális tubulus hámsejtekben. A nyíl ezen magok egyikére mutat (3. csoport, T21 d, transzmissziós elektronmikroszkópia). Nagyítás, × 5000.

Apoptotikus index a négy kísérleti csoportban a T21-nél. * Statisztikailag szignifikánsan magasabb, mint az 1. csoport.

A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick-end jelölő – pozitív hámsejtek proximális és disztális tubulusokban. A nyilak apoptotikus sejteket jeleznek (3. csoport, T21 d). Nagyítás, × 50.

A HCBD-vel (10, 25 és 50 mg/testtömeg-kg) végzett előzetes kísérletek során a fénymikroszkópia és a TEM két HCBD-injekció után 7 napos időközönként, egymást követő EG beadás nélkül, a fentiekhez hasonlóan nagyon hasonló képeket tárt fel, ugyanazokkal a " dózisfüggő válasz ”, de azzal a figyelemre méltó kivétellel, hogy a legmagasabb dózisoknál (25 és 50 mg/testtömeg-kg) a második HCBD beadása után még 7 nappal sem figyeltek meg TUNEL-pozitív sejteket. A vesében kristálylerakódást nem figyeltek meg.

Vita

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy enyhe hiperoxalurikus patkányokban a kristályuria még a HCBD által okozott nagyon szerény tubuláris sértés miatt is kiváltható, amint azt a 2. csoport patkányai mutatják. Ezt a tubuláris károsodást kristályuria okozhatja enyhe hiperoxaluria jelenlétében Kumar és mtsai. (10) és Hackett és mtsai. (11) nagyon nagy dózisú gentamicin ismételt beadása, de ez sokkal súlyosabb tubuláris károsodást okozott, amelyet a proximális tubuláris nekrózis jellemez, a hám fokális eltávolításával.

Kísérleti tervünk különböző körülményeket ölel fel, a nagyon alacsony fokútól a súlyos tubulus toxicitásig. Ami a szövettani és enzimatikus változásokat illeti, az EG beadásnak nem volt súlyosbító hatása a HCBD toxicitására, az apoptózis kivételével. Valójában a hiperoxaluria és a magasabb HCBD dózisok (25 és 50 mg/testtömeg-kg) társulása tubuláris sejtek apoptózisához vezetett, de önmagukban sem volt apoptotikus hatásuk. In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a CaOx metasztabilitási határán lévő oxalátkoncentrációk a TE-sejtek apoptózisát okozzák (9), de ezek a koncentrációk valószínűleg magasabbak voltak, mint az intraluminális oxalátkoncentrációk, amelyek feltehetően elérték az in vivo modellünket. A HCBD a vesesejtek apoptózisára gyakorolt hatásáról mindeddig nem számoltak be, és előzetes tanulmányunkban nem mutatott ki apoptotikus aktivitást, ha EG nélkül adták be. Adataink következésképpen az EG és a HCBD szinergetikus hatását sugallják az apoptózisra. Ennek feltételezhető mechanizmusaként az intracelluláris glutation HCBD általi redukciója (24) ronthatja a reaktív oxigénfajok sejtpufferelését, amelyet az oxalát által kiváltott oxidatív stressz okoz (25, 26). A reaktív oxigénfajták ilyen kiegyensúlyozatlan hozzáférhetősége a vese tubuláris sejtek apoptózisának potenciális kiváltója (27).

Korrelatív bizonyítékok utalnak arra, hogy az apoptózis növelheti a kristályképződést és a vesetubuláris sejtekhez való tapadást (9,28,29). Azonban az apoptózis és a kristályuria profilja modellünkben különbözött, mivel a kristályuria egyértelműen még a nagyon enyhe elváltozások által is kiváltott volt, amelyek apoptózis nélkül emelkedett ACE enzimuriában tükröződtek, mint a 2. csoportban. Ezenkívül a kristályuria már a első HCBD injekció, amely képtelen volt kiváltani a vesesejtek apoptózisát. Ezért úgy tűnik, hogy az apoptózis nem játszik szerepet ebben a modellben megfigyelt kristályuriaban. Sőt, úgy tűnik, hogy modellünkben az intraluminális kristályok hiánya ellentmond a vese tubuláris sejtek apoptózisának a kristályadhézióban betöltött szerepével. Ha azonban kísérletünk apoptózisa olyan sejteket érintett, ahol vagy amikor nem voltak kristályok, ez megmagyarázhatja a kristálykötés és az intrarenális kristálylerakódás hiányát. Következésképpen további vizsgálatokra van szükség a TE-sejt apoptózis bármilyen in vivo szerepének megerősítéséhez a litogenezisben, és modellünk ebben az értelemben hasznos lehet.

A négy kísérleti csoport nem különbözött az oxaluria, a calciuria vagy a vizelet pH-ját illetően, és ezekben a paraméterekben nem volt változás a vizsgálat során, különösen a HCBD beadását közvetlenül követő időszakokban. Következésképpen úgy gondoljuk, hogy a modellünkben a kristályuria néhány tubuláris sejtmembrán (amelynek az ACE enzimuria a markere) leválásának volt köszönhető, ahogyan azt Khan és munkatársai javasolják. (30), nem pedig az oxaluria változásával vagy a vizelet túltelítettségével.

Ebben a modellben nem találtunk intrarenális kristályokat, és ellentmond a gentamicint és az EG-t használó hasonló modell kimenetelének (10,11). Már említettük a két modell közötti különbségeket, és azt javasoltuk, hogy a mieink sokkal kevésbé súlyos kihívást jelentenek a vese tubulusok számára. Valójában nem indukáltunk TE denudációt, amelynek állítólag fontos szerepe van annak a csőszerű alapmembránnak a kitételében, amelyhez CaOx kristályok tapadnak (9). Evan és munkatársai által közölt megállapítások fényében azonban (31) amelyek támogatják a Randall-plakk intersticiális eredetét és annak szerepét a vesemedencében a kövek keletkezésének és növekedésének elősegítésében, az a feltételezés, hogy a kristályoknak a TE-hez kell tapadniuk a növekedéshez és a klaszter kialakulásához, nem releváns.

Adataink szerint kétlépcsős (vagy kétütemű) modell javasolható: Vizelet-anyagcsere-kockázati körülmények között (az első lépés, azaz finom hiperoxaluria bizonyos küszöb alatt), amelyek szükségesek, de nem elégségesek a nephrolithiasis kialakulásához, van egy kiváltó esemény (második lépés), amely kőképződést okoz. Javasoljuk, hogy ez egy olyan állapotra vonatkozik, amely hasonló az emberi ICN-hez. Valójában Evans és mtsai. (31) nem mutatott CaOx kristályt az ICN-ben szenvedő betegek vesebiopsziájánál, akik enyhe (marginális) krónikus hiperoxaluriát mutathatnak be a vesekövek számos rizikófaktora között. A forgatókönyv más abban a patkányban, amelyet sokkal nagyobb EG bevitel vált ki, amelyben az oxaluria elég magas ahhoz, hogy spontán kristályosodjon a vesében. Ez a körülmény inkább hasonlít az elsődleges hiperoxaluriában szenvedő betegeknél tapasztaltra.

Következtetés

Úgy gondoljuk, hogy a kövek patogenezisének magyarázatához meg kell töltenünk a kőre hajlamosító állapotok (pl. Hypercalciuria, hyperoxaluria, hypocitraturia, alacsonyabb kristályosodást és aggregációt gátló aktivitás) közötti rést, amelyek általában krónikusak, és a kő között epizód, amely szórványosan fordul elő. Feltehetően történik valami, ami a kényes vizeletegyensúly egyensúlyát eldobja, ezáltal a vesekő epizódhoz vezet. Ilyen feltételezett esemény lehet egy olyan eseménynek való kitettség, amely képes károsítani a TE-t és ezáltal megkönnyíteni a kristályok tapadását vagy akut kristályuria kialakulását. Az, hogy az ipari/környezeti nefrotoxinok, mint például a HCBD, valóban szerepet játszanak-e, még mindig erősen spekulatív és specifikus tanulmányokat igényel.

Köszönetnyilvánítás

A cikk kísérleteinek egy részét az Eurolithiasis Society EULIS kilencedik ülésén mutatták be, a második Eulis-szimpóziumon, 2003. június 11–14., Isztambul, Törökország, és absztrakt formában tették közzé (Exp Urol 31: 32, 2003).