Az epesavak modulálják a glükokortikoid anyagcserét és a hypothalamus – hipofízis – mellékvese tengelyt obstruktív sárgaságban Akadémiai kutatási cikk a "Biológiai tudományok"

A biológiai tudományokról szóló tudományos tanulmány kivonata, tudományos cikk szerzője - Alison D. McNeilly, David P. Macfarlane, Emmett O’Flaherty, Dawn E. Livingstone, Tijana Mitić és mtsai.

Hasonló témák a biológiai tudományokban, tudományos cikk szerzője - Alison D. McNeilly, David P. Macfarlane, Emmett O’Flaherty, Dawn E. Livingstone, Tijana Mitić et al.

Akadémiai tanulmány a következő témáról: "Az epesavak modulálják a glükokortikoid anyagcserét és a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt obstruktív sárgaságban"

EURÓPAI SZÖVETSÉG A MÁJ VIZSGÁLATÁHOZ

HEPATOLÓGIAI FOLYÓIRAT

Az epesavak az obstruktív sárgaságban modulálják a glükokortikoid anyagcserét és a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt.

Alison D. McNeilly1 '*, David P. Macfarlane1, Emmett O'Flaherty1, Dawn E. Livingstone1, Tijana Mitic1, Kirsty M. McConnell1, Scott M. McKenzie2, Eleanor Davies2, Rebecca M. Reynolds1, Helle C. Thiesson3, Ole Skott3, Brian R. Walker1, Ruth Andrew1

1 Endokrinológiai osztály, Kardiovaszkuláris Tudományközpont, Queen's Medical Research Institute, Edinburgh Egyetem, 47 Little France Crescent, Edinburgh EH16 4TJ, Egyesült Királyság; 2MRC vérnyomáscsoport, Glasgow Kardiovaszkuláris Kutatóközpont, Glasgowi Egyetem, 126 University Place, Glasgow G12 8TA, Egyesült Királyság; 3Fiziológia és farmakológia, Dániai Egyetem, DK-5000 Odense C, Dánia

Háttér és célok: A hipotalamusz-pitui-tanács-mellékvese tengelyének elnyomása cirrhosisban és cholestasisban fordul elő, és az epesavak fokozott koncentrációjával jár. Megvizsgáltuk, hogy ezt az epesavak közvetítik-e, amelyek károsítják a szteroid clearance-t azáltal, hogy gátolják a glükokortikoid anyagcserét az 5p-reduktáz segítségével.

Módszerek: Az epesavak glükokortikoid metabolizmusra gyakorolt hatását in vitro tanulmányozták máj szubcelluláris frakciókban és hepatoma sejtekben, lehetővé téve az 5p-reduktáz kinetikájának és transzkriptumának számszerűsítését. Az anyagcserét ezt követően in vivo vizsgálták patkányokban étrendi manipuláció vagy epevezeték ligálás után. Végül a glükokortikoid anyagcserét obstruktív sárgaságú embereknél értékelték.

Eredmények: Patkány májcytosolban a chenodeoxycholsav kompetitíven gátolta az 5p-reduktázt (K 9,19 ± 0,40 iM), és csökkentette transzkriptumának bőségét (H4iiE sejtekben) és promoter aktivitását (riporter rendszer, HepG2 sejtek).

Wistar patkányokban az étkezési chenodeoxycholsav (1% w/w chow) gátolta a máj 5p-reduktáz aktivitását, csökkentette a 3a, az 5p-tetrahidrokortikoszteron vizelettel történő kiválasztását és a mellékvesék súlyát. Ezzel szemben a zsírmentes diéta elnyomta az epesavszintet és a máj 5p-reduktáz aktivitásának növekedését, a zsírmentes diéta CDCA-val történő kiegészítése csökkentette az 5p-reduktáz aktivitást, és

Kulcsszavak: Epesav; Glükokortikoid; 5p-reduktáz; Mellékvese; Sárgaság. 2009. augusztus 2-án kapott; felülvizsgált formában érkezett 2009. szeptember 30 .; 2009. október 15-én elfogadott; online elérhető 2010. március 4-én

qFinanszírozás: Ezt a munkát a Wellcome Trust, a British Heart Foundation, az Endokrinológiai Társaság, az Orvosi Kutatási Tanács, a Danish Heart Foundation és a Danish Hypertension Society támogatásával támogatták. * Levelezési cím. Tel .: +44 1382 496589; fax: +44 1382 633923. E-mail cím: [email protected] (A.D. McNeilly). Rövidítések: HPA, hipotalamusz-hipofízis-mellékvese; ACTH, adrenokortikotrop hormon; 3aHSD, 3a-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz; FXR, farnezoid X receptor; Cyp7a1, koleszterin-7a-hidroxiláz; 11pHSD, 11 p-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz; BDL, epevezeték ligálása; THB, tetrahidrokortikoszteron; DHB, dihidrokort-ikoszteron; GCMS, gázkromatográfia tömegspektrometria; CDCA, kenodeoxikolsav; CA, kolinsav; DCA, dezoxikolsav; GCDCA, gliko-CDCA; K inhibitor állandó; TCDCA, tauro-CDCA; DMEM, a Dulbecco által módosított Eagle táptalaj; PCR, polimeráz láncreakció; FF, zsírmentes; ECRP, endoszkópos retrográd kolangiopancreatográfia; ANOVA, varianciaanalízis; ALT, alanin-transzamináz; ALP, alkalikus foszfatáz; Cyp11b1, 11p-hidroxiláz; NEFA, nem észterezett zsírsavak; SEM, az átlag standard hibája.

vizelet 3a, 5ß-redukált kortikoszteron. A patkányok kolesztázisa elnyomta a máj 5ß-reduktáz aktivitását és a transzkript bőségét.

Nyolc obstruktív sárgaságú nőnél a 3a, az 5ß-tetrahidrokortizol relatív vizelettel történő kiválasztása szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az egészséges kontrollokban.

Következtetés: Ezek az adatok arra utalnak, hogy az epesavak új szerepet játszanak a máj glükokortikoid-clearance-jének gátlásában, amely elégséges ahhoz, hogy elnyomja a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely aktivitását. A megemelkedett máj epesavak májbetegségben a mellékvese elégtelenségét okozhatják.

A hipotalamusz-hipofízis-mellékvese (HPA) tengely aktiválása és a kortizol fokozott felszabadulása döntő fontosságú a stresszre adott sikeres válasz szempontjából, de ez a homeosztatikus mechanizmus májbetegségekben megszakadt. Cirrhosisban a mellékvese ACTH-val szemben mutatott csökkent reakciókészsége hozzájárul a megnövekedett mortalitáshoz haemodinamikai károsodással [1,2]. Alacsony dózisú hidrokortizonnal történő helyettesítés jelentősen javítja a sokk feloldódását és a túlélést [3]. Hasonlóképpen, kolesztatikus patkányokban a kortikotrofin-felszabadító hormon szekréciója elnyomódik, és a mellékvese stresszre adott válasza károsodik [4]. A HPA tengely diszregulációjának oka azonban nem ismert.

Ha a kortizol metabolizmusa károsodott, akkor a HPA tengely negatív visszacsatolásos szabályozása az ACTH-szint elnyomását, a mellékvese atrófiáját és a kortizol termelésének csökkent sebességét okozza, ezt a mintát a cirrhosis is mutatja [5,6]. Mivel a máj a kortizol-anyagcsere fő helyszíne [7], a májbetegségben a kortizol csökkent károsodását a csökkent funkcionális májtömeg vagy a glükokortikoid metabolizmus gátlója okozhatja.

A glükokortikoidokat inaktiváló májenzimek közé tartoznak az 5a- és 5p-reduktázok és a 3a-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz (3aHSD), amelyek a kortizolt tetrahidrometabolitokká alakítják [8]. Ezenkívül az 5p-reduktáz és a 3aHSD részt vesz az epesav szintézisében [9]. Az epesavak citotoxikusak, így képződésüket és eliminációjukat szorosan szabályozza a fehérjéket kódoló gének up-szabályozása, amely indukálja méregtelenítésüket és/vagy

kiválasztás és a gének elnyomása révén (főleg a farnesoid X receptoron (FXR) keresztül) kódolva a koleszterin katabolizmust szabályozó fehérjéket, például a koleszterin 7a-hidroxilázt (CYP7A1) [9].

A vese 11pHSD2 epesavak általi gátlása rontja a glükokortikoidok inaktiválódását [10,11], és hozzájárul a cirrhosisban és kolesztázisban [12], valamint az epevezeték-ligálás (BDL) [13] során megfigyelt nátrium-visszatartáshoz és káliumpazarláshoz [13]. mineralokortikoid receptorok a felesleges kortizolban. Az epesavak gátolják a máj 11pHSD1-ét is [8,14-16], megakadályozva a glükokortikoidok reaktivációját. A glükokortikoid anyagcserére gyakorolt hatást, kivéve 11 pHSD-értéket, nem vizsgálták, bár az aldoszteron 5b-redukciójának epesavak általi gátlását bizonyították [17].

Feltételeztük, hogy az epesav felhalmozódása a kolesztázisban gátolja a máj 5b-reduktázt, hozzájárulva a glükokortikoid-clearance károsodásához és a HPA-tengely aktivitásának gyengüléséhez. Az epesavak hatását a máj 5p-redukciós szintjének aktivitására és transzkripciójára in vitro tanulmányozták májban és hepatoma sejtekben. Az epesavak HPA-aktivitásra gyakorolt hatását in vivo értékelték patkányokban étrendi manipulációt [18] vagy BDL-t követően. A glükokortikoid anyagcserét embereken is tanulmányozták, miután az epekövek elzárták a közös epeutat.

Anyagok és metódusok

Források, hacsak nincs megadva: oldószerek (Rathburn, Walkerburn, Egyesült Királyság), sejttenyésztési reagensek (Gibco BRL, Paisley, Egyesült Királyság), molekuláris biológiai reagensek (Promega, Southampton, Egyesült Királyság), vegyszerek (Sigma-Aldrich, Poole, Egyesült Királyság), radiokémiai anyagok (GE) -Egészségügy, Aylesbury, Egyesült Királyság).

Az epesavak hatása az enzim kinetikájára in vitro

Minden kísérlet az Egyesült Királyság Belügyminisztériumának vagy a Dán Állatkísérleti Felügyelőség útmutatásait követte. A hím Wistar patkányokat (9 hét; Harlan Olac, Bicester, Egyesült Királyság) lefejtéssel (08:00 h) feláldoztuk 60 másodpercen belül, miután megzavartuk őket.

[3H] 4-tetrahidrokortikoszteront (5b-THB) (5b-reduktáz aktivitás) májcytosolban (100 ig/ml fehérje) állítottunk elő, 4 órán át inkubáltunk [3H] 4-kortikoszteron-ronnal (25 nM), kortikoszteronnal (975). nM, IC50; 0,01-1000 iM, kinetika) és egy NADPH-generáló rendszer [19]. Az 5p-dihidrokortikoszteron (5p-DHB; 2 iM) átalakulását 5p-THB-vé (3aHSD aktivitás) mértük a fenti inkubálást (10 perc) követően. Az 5p-THB-t gázkromatográfiás tömegspektrometriával (GCMS) számszerűsítettük [20].

Epesavakat (chenodeoxycholic acid (CDCA), cholic sav (CA), deoxycholic acid (DCA), glyco-CDCA (GCDCA) vagy tauro-CDCA (TCDCA) (10-2-10-9M) adtak az inkubációkhoz. A sebesség (IC50) értékét az epesav nélküli kontrollokhoz viszonyítva számítottuk, a Kj értékeket a kompetitív gátlás globális illesztési modelljével (Kmapp = Km * (1 + № Y = Vmax * X/(Kmapp + X)) számítottuk CDCA alkalmazásával. IC50.

RPCI-11 HS BAC 386M10 klónból (Invitrogen, Egyesült Királyság). Egy konstrukciót nagy pontosságú PCR-amplifikációval állítottunk elő a következő oligonukleotidok felhasználásával, beépítve egy Kpn-helyet (aláhúzva) és elvégezve a megerősítő szekvenálást.

5'AKR1D1 (-383), GGTACCAGTCCTGCTGCATCCAAATC;

3'AKR1D1 (+446) GGTACCTGTGGAGAACCTGACTGTAGGA.

Amplimereket inszertáltunk a promóter nélküli szentjánosbogár luciferáz riporter vektor, a pGL3-Basic többszörös klónozási helyére, és orientációjukat megerősítettük. A luciferáz konstrukcióból származó Maxi DNS készítményeket Qiagen maxi készletek felhasználásával készítettük (Crawley, Egyesült Királyság).

A humán hepatoblastoma sejtvonalat, a HepG2-t (ATCC, Rockville, USA) DMEM-ben tenyésztettük, borjúmagzati szérummal, L-glutaminnal és penicillinnel kiegészítve, mint fent. Plazmid DNS (

10 ig) sejtekbe transzfektáltunk [22], a pCH110 plazmiddal (2 ig; p-galaktozidáz (p-Gal), Amersham, Egyesült Királyság) együtt. A transzfekció után 24 órával CDCA-t (50 iM) vagy etanolt adunk hozzá. A luciferáz aktivitást sejtlizátumokban vizsgáltuk 72 órával a transzfekció után [23]. A transzfekció hatékonyságát a Tropix Galacto-Light kit (Cambridge Bioscience, Egyesült Királyság) segítségével végzett p-Gal aktivitással értékeltük. A kísérleteket háromszor háromszor hajtottuk végre, egynél több plazmid-készítmény felhasználásával.

Az epesavak hatása in vivo patkányokban Az epesavak étrendi kezelése

A hím Wistar patkányokat (4-6 hét; n = 8/csoport) külön-külön tartottuk (6 nap). Az első eljárásban az állatok standard chow ± CDCA-t kaptak (1% w/w, 4 hét). A másodikban zsírmentes (FF) étrendet kaptak (D05052506; Research Diets Inc., USA) ± CDCA (1 tömeg/tömeg%; D05052507).

A glükokortikoidok napi termelését 6 napon át metabolikus ketrecekben tartott állatok vizeletében vizsgálták, 3 hét után a megfelelő étrenden. Csak az első protokollban vizsgálták a visszafogási stresszre adott válaszokat 2,5 hetes diéta után. Az állatokat hozzáfogták a kezeléshez (7 nap), majd visszatartó csövekbe helyezték (20 perc, 08:00), majd visszatették normál ketrecbe. Vért nyertünk 0-nál (közvetlenül az elzárás előtt), és 20, 40, 60 és 90 perccel a visszatartás után.

Epeutak ligálása (BDL)

A közös epevezetéket hím Wistar patkányokban (n = 6/csoport; M&B Ejby, Dánia) vagy álműtéten átesett patkányokban ligáltuk. A patkányokat 7 hét után lefejezéssel feláldoztuk, amikor sárgaság és hepatosplenomegalia nyilvánvaló volt, és dekompenzált májelégtelenség lépett fel [13].

Ex vivo mérések

Az enzimaktivitásokat a következő szubsztrátkoncentrációk mellett határoztuk meg: 5p-reduktáz (25 nM, 1 iM) és 3aHSD (1 iM). A plazma és a máj biokémiáját, valamint a vizelet szteroidjait meghatároztuk [19,20,24,25]. Az epesavakat kvantitatívan meghatároztuk Total Bile Acid Kit (Trinity Biotech, Írország) [26] alkalmazásával, a májfunkciós teszteket pedig egy moduláris P analizátorral (Roche Diagnostics, Svájc). Az 5p-reduktáz és a Cyp11b1 transzkriptumait qPCR-rel [19,27] számszerűsítettük, és 18S RNS-re vagy p-aktinra (Applied Biosystems) normalizáltuk. A Cyp7a1 transzkript bőségét Northern blot analízissel számszerűsítettük [24], és U1-re normalizáltuk (M14386) [19].

Az epesavak hatása a transzkriptum bőségére a tenyésztett sejtekben

A H4iiE-sejteket (ECACC, Egyesült Királyság) Dulbecco módosított Eagle-táptalajában (DMEM, Invitrogen, UK) tartottuk fenn, borjúmagzati szérummal (10 térfogat%), penicillinnel (100 NE/ml), sztreptomicinnel (100 ig/ml) kiegészítve. és L-glutamin (2 mM) (37 ° C, nedvesített szén-dioxid: levegő (5:95)). A sejteket friss táptalajra helyeztük 1 órával epesav (100 iM) vagy vivőanyag (etanol, DCA> CA (1A-C. Ábra) hozzáadása előtt). Az epesavak és konjugátumaik nem gátolták a 3aHSD-t (14,29 ± 2,53 13,25 ± 3,02 CDCA; 13,87 ± 4,41 TCDCA; 18,44 ± 0,76 GCDCA nmol/mg/h). A CDCA az 5b-reduktáz kompetitív inhibitora volt (1D. Ábra).

Az epesavak hatása a metabolizáló enzimek mRNS-szintjére in vitro

A CDCA csökkentette az 5b-reduktáz (2A. Ábra) és a Cyp7aî transzkriptum bőségét, a 3aHSD viszont nem. A CDCA elnyomta az 5b-reduktáz promóterének aktivitását is (2B. Ábra).

Patkányok CDCA-kiegészítésének hatása a standard chow-étrendre (1. táblázat)

A CDCA növelte a plazma és a széklet összes epesav-tartalmát, és csökkentette a máj Cyp7al mRNS-ét. A CDCA csökkentette a testsúlyt, de nem csökkentette a máj súlyát vagy a glikogén tartalmát. A CDCA hajlamos volt csökkenteni a máj triglicerid tartalmát (p = 0,06), csökkentette a plazma glükóz- és inzulinszintjét, valamint növelte a plazma HDL-koleszterinszintjét. A CDCA-val kezelt állatok szérumának ALT-értéke magasabb volt, mint a kontrollokban, de nem mutattak változást az ALP-ben vagy az albuminban.

■ CDCA xTCDCA o GCDCA o DCA a CA

-5 -4 -3 -2 -1 -9 -8 -7 log koncentráció (M)

IC50 (mM) 5ß-reduktáz

CDCA 2,7 ± 0,2 DCA 78,1 ± 1,9 * # CA 665 ± 4,6 * GCDCA 2,3 ± 0,3 TCDCA 1,7 ± 0,03

1. ábra: Az 5p-reduktáz epesavak általi gátlása. 5p-A kortikoszteron redukciója (A) CDCA, CA, DCA (B) CDCA, GCDCA, TCDCA jelenlétében. Sebesség és kontroll (100%), epesavak nélkül. (C) A reakciók IC50-értéke. (D) Az 5p-reduktáz CDCA általi kompetitív gátlását mutató Lineweaver-Burke-diagramok (nyitott négyzetek: 2,5 x 10-6 M) (szemben a hordozóval (töltött)). Átlag ± SEM; n = 5. 'p 0,10, r 0,20, r