Az erjesztetlen és erjesztett tehén- és juhtej hatása a bél mikrobiotájára

Elizabeth A. Rettedal

1 Food Nutrition & Health Team, AgResearch (Grasslands Research Center), Palmerston North, Új-Zéland

2 Riddet Intézet, Massey Egyetem, Észak-Palmerston, Új-Zéland

Eric Altermann

1 Food Nutrition & Health Team, AgResearch (Grasslands Research Center), Palmerston North, Új-Zéland

2 Riddet Intézet, Massey Egyetem, Észak-Palmerston, Új-Zéland

Nicole C. Roy

1 Food Nutrition & Health Team, AgResearch (Grasslands Research Center), Palmerston North, Új-Zéland

2 Riddet Intézet, Massey Egyetem, Észak-Palmerston, Új-Zéland

3 The High-Value Nutrition National Science Challenge, Palmerston North, Új-Zéland

Julie E. Dalziel

1 Food Nutrition & Health Team, AgResearch (Grasslands Research Center), Palmerston North, Új-Zéland

2 Riddet Intézet, Massey Egyetem, Észak-Palmerston, Új-Zéland

Társított adatok

A szekvenálási adatokat az NCBI SRA archívumába raktuk le a Bioproject # PRJNA473571 alatt.

Absztrakt

Bevezetés

Úgy tűnik, hogy a „Te vagy az, amit eszel” régi mondás pontosan tükrözi a bél mikrobiomjának összetétele és működése mögött rejlő bizonyítékokat. Míg más tényezők, mint például a genetika (Turnbaugh et al., 2009), úgy tűnik, szerepet játszanak, a környezeti tényezők, például az étrend, rengeteg bizonyítékot gyűjtöttek össze a bélmikrobiális közösségek felépítésében és módosításában gyakorolt hatásukról (Spor et al., 2011; David és mtsai, 2014; Bokulich és mtsai, 2016). A mikrobiom létfontosságú és összetett szimbiotikus kapcsolatban áll gazdájukkal, és az optimális egészség megőrzéséhez szükségesnek tűnik a kettő közötti egyensúly. Bár korlátozott számú tanulmány van, amely konkrétan bizonyítja az okot és a következményt (azaz a mikrobiota diszbiózisa okozza-e a mikrobiotát vagy a mikrobiotát elmozdító betegséget), számos egészségügyi állapot, köztük az elhízás, a cukorbetegség és a gyulladásos bélbetegség a bél mikrobiomjának elmozdulásaihoz kapcsolódnak (Ley és mtsai, 2005; Frank és mtsai, 2007; Cho és Blaser, 2012). Megpróbálta tisztázni, hogy mi hajtja és képezi a kiegyensúlyozott bélmikrobiomot, és hogyan tudjuk azt fenntartani vagy irányítottan megváltoztatni, a kutatás arra ösztönözte az ételeket, hogy megértsék a bél mikrobiomját.

Az erjesztett élelmiszerek hosszú múltra tekintenek vissza az emberekben, és számos egészségügyi előnyhöz kapcsolódnak (Hata és mtsai., 1996; Kawase és mtsai., 2000; Guyonnet és mtsai., 2007). Az erjesztett termékek fogyasztása a koleszterin és a vérnyomás szintjének javulásához, a 2-es típusú cukorbetegség kockázatának csökkenéséhez és a bél rendellenességeinek csökkenéséhez kapcsolódik (Chen és mtsai, 2014; Fekete és mtsai, 2015; Cardoso Umbelino Cavallini és mtsai., 2016; Díaz-López és mtsai, 2016; Laatikainen és mtsai, 2016; Nagata és mtsai, 2016). Fermentált élelmiszerek előállításához élő mikroorganizmusokat adnak az élelmiszerekhez, és az anyagcsere-tevékenységek módosítják a fizikai és táplálkozási jellemzőket azáltal, hogy összetett összetevőket bontanak és melléktermékeket képeznek.

Bár számos tanulmány az erjesztett élelmiszerekben élő élő mikroorganizmusok megfigyelt egészségügyi előnyeit könyveli el, néhány tanulmány kimutatta az életképes mikroorganizmusokat nem tartalmazó fermentált termékek jótékony hatásait (Ouwehand és Salminen, 1998). Ezeket a hatásokat a nem életképes baktériumok közvetlen kölcsönhatásának tulajdonítják az immunrendszerrel vagy a mikrobiális fermentáció termékeivel, például a bioaktív peptidekkel (Ouwehand és Salminen, 1998). E peptidek tisztított változatai kimutatták, hogy hatással vannak a baktériumok szaporodására (Hartmann és Meisel, 2007; Erdmann és mtsai, 2008), amely potenciálisan módosíthatja a bél mikrobiota összetételét és működését (funkcióit).

A joghurt az egyik leggyakrabban fogyasztott erjesztett étel. Habár a tehéntejet használják leggyakrabban, számos más emlőstej áll rendelkezésre a joghurt kereskedelmi előállításához. A nem szarvasmarha-tejtermékek használata egyre népszerűbb a nyugati piacokon, mivel az allergiás vagy tehéntej iránti érzékenységű emberek képesek tolerálni a nem szarvasmarhafélékből készült termékeket (El-Agamy, 2007). Az emlősfajok tejének táplálkozási és ízprofilja is eltér, ami ösztönözheti fogyasztásukat.

Jelenleg nincs megértésünk arról, hogy az erjesztett élelmiszerek fogyasztása mennyiben különbözik a bél mikrobiomjára gyakorolt hatásától a nem erjesztett formáktól. Az erjesztésről ismert, hogy megváltoztatja a táplálkozás elérhetőségét és a bioaktív vegyületeket, ideértve a bioaktív peptideket is, amelyek várhatóan befolyásolják a mikrobiotát (Azuma et al., 1984; Liepke et al., 2002). Van némi vita arról is, hogy az erjesztett élelmiszerek mennyire képesek befolyásolni a bél mikrobiális közösségeit (Veiga et al., 2010, 2014; McNulty et al., 2011). Mivel a tejösszetevők összetétele az emlősökben eltérő, előfordulhatnak különbségek a mikrobiotára gyakorolt hatásukban, valamint az elő- és utófermentációban.

Célunk a tehénből és juhból származó erjesztetlen és erjesztett tej (joghurt) hatásának jellemzése a bél mikrobiotájának összetételére. Feltételeztük, hogy megfigyelhetjük az erjedés miatti baktériumok közötti különbségeket, de az állati eredet erősebben befolyásolja ezeket a különbségeket. A patkányokat szilárd tejmentes táplálékkal etették, kiegészítve a négy tejelő kezelés egyikével 2 héten keresztül. Vakbaktériumaikat a sokféleség, a közösség összetétele és a metaadatokkal való összefüggések figyelembevételével jellemezték.

Anyagok és metódusok

Az ebben a vizsgálatban használt patkányok egy másik kísérlet részei voltak (párhuzamosan), amely megvizsgálta ezen tejelő kezelések hatását az átmeneti időre, és jellemezte peptidprofiljaikat és potenciális bioaktivitásukat (Dalziel et al., 2018). Itt külön értékeltük a cecalis tartalmat a vizsgálat befejezése után. Az állatkísérletekkel és a tejitalokkal kapcsolatos módszereket Dalziel et al. (2018), de az egyértelműség kedvéért itt megismételte.

Tejitalok kezelése

Tehén sovány tejport [SMP 001 (111115)] (38% fehérje, ®) adtunk hozzá. Ezt a kiindulási kultúrát megbízhatósága miatt választották egy állandó termék iható joghurtként történő előállításában. Az oltott tejet 43 ° C-on inkubáltuk, amíg a pH 4,5-re (4-5 óra) nem csökkent. A joghurtokat ezután sekély tálcákban -20 ° C-on lefagyasztották. A baktériumok életképességének csökkentése és a fagyasztva szárítás javítása érdekében a joghurtokat -5 ° C-ra történő felolvasztással és -20 ° C-on történő fagyasztással fagyasztva szárítás előtt megolvasztották.

A tejitalokat felhasználás céljából úgy készítettük elő, hogy a tejet vagy a joghurtport 3% fehérje koncentrációjú vízben oldották fel, és 30 másodpercig keverték. Az italokat naponta készítették, és két takarmányként adagolták, felüket 4 ° C-on tartva az állatkísérletben történő felhasználás előtt. 3% -os fehérjekoncentrációt választottunk, így a joghurt szabadon folyó iható anyagként szállítható.

A S. thermophilus és az L. delbrueckii ssp. Baktériumok életképességének meghatározása A tejitalokban található bulgaricust tejben és joghurtokban keverés közben (3 s) 3% fehérjetartalmú vízben szuszpendáltuk. A sorozatos hígításokat foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS) hajtottuk végre, és szelektív agarlemezeken elosztva 100 μl-t hármasban. A S. thermophilust 37 ° C-on 24–48 órán át tenyésztettük Mitis Salivarius agaron, 5% CO2-körülmények között. L. delbrueckii ssp. A bulgaricust 45 ° C-on 72 órán át tenyésztettük MRS agaron (pH 5,2) (Fort Richard Laboratories Ltd, Auckland, Új-Zéland) anaerob körülmények között. L. delbrueckii ssp. A bulgaricust egyetlen tej- vagy joghurtmintában sem sikerült kimutatni. A S. thermophilust a tehénjoghurtra (4,5 × 106 CFU/ml) és juhjoghurtra (1,5 × 104 CFU/ml) nyerjük ki, de a tejből nem nyertük ki.

Állatgondozás és tanulmánytervezés

Az állatkísérletet az AgResearch Grasslands Állatetikai Bizottság (Palmerston North, Új-Zéland) (AE13501) hagyta jóvá az Állatvédelmi Törvénynek (1999, Új-Zéland) összhangban. Negyven hím Sprague-Dawley patkányt (kezdeti súlya 404 ± 27 g) az AgResearch kisállattenyésztő egységtől (Hamilton, Új-Zéland) szereztünk be. A patkányokat egyenként állandó 21 ° C-on tartottuk 12/12 órás világos/sötét ciklus mellett. 10 hetes kortól kezdve a patkányokat tejmentes szilárd AIN-93M OpenSource rágcsáló étrenddel (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, Egyesült Államok) táplálták tojásfehérje fehérjeforrással. A patkány szilárd étrend összetételét az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. 12 hetes korában a négy tejital közül az egyik [CM, tehéntej; CY, tehénjoghurt; SM, juhtej; SY, juhjoghurt] 14 napig ad libitum adtunk (csoportonként 10 patkány). Hetente háromszor rögzítették az általános egészségügyi pontszámot, a testsúlyt és az étrendi bevitelt. A vizsgálat befejezése után a patkányokat CO2 túladagolással történő inhalációval és méhnyak diszlokációval eutanizálták. A vakbélmintákat aszeptikusan gyűjtötték patkányoktól, és azonnal -80 ° C-on tárolták.

Mikrobiota szekvenálás és elemzés

A szekvencia adatait mothur alkalmazásával elemeztük Schloss és mtsai. (2009, 2011). Röviden: páros végű leolvasásokat (3 519 095 előminőség-ellenőrzés páros leolvasás) állítottunk össze, és minőségellenőrzésen esett át, amely eltávolította a nyolcnál nagyobb bázist és homopolimert tartalmazó olvasmányokat. Az összes bázis átlagos minőségi pontszáma meghaladta a 30-at, az átlagos szekvenciahossz pedig 416 bp volt. A szekvenciákat ezután összehangolták a SILVA adatbázissal (132. kiadás) (Quast et al., 2013). A szekvenálás összehangolását és a szűrést követően a szekvenálás leolvasása egy előfürtező lépésen (4 bp) ment keresztül, amelynek célja a szekvenálási hibák denoise és csökkentése. Kiméra szekvenciákat detektáltunk és eltávolítottunk a VSEARCH segítségével (Rognes et al., 2016). A taxonómiai besorolást követően a nem bakteriális szekvenciákat eltávolítottuk az elemzésből, és a szekvenciákat OTU-kba csoportosítottuk 97% -os határérték mellett. Az összes minőség-ellenőrzési és szűrési lépést követően összesen 1 434 251 olvasás maradt, mintánként átlagosan 29 880 olvasás. A mintánkénti szekvenciák számát 17 323-ra almintába vittük, hogy az összes downstream elemzés során a minták közötti olvasatok száma kiegyenlítődjön. A BIOM táblákat mothurból exportálták más elemzési programokban való felhasználásra. A mothur taxonómiai besorolásokból származó nyers kibocsátás az S2 kiegészítő táblázatban található.

Az alfa-diverzitást a Shannon-index felhasználásával számítottuk ki. A taxonómiai grafikonokat a mothur osztályozásai alapján készítettük. A LEfSe-t használták a taxonómiai jellemzők jelentősen eltérő azonosítására (p ®. Többszörös lineáris regressziós elemzéseket végeztek Calypso (Zakrzewski et al., 2017) alkalmazásával a korábban gyűjtött béltranzit-pontszámokkal korreláló bakteriális OTU-k meghatározásához (Dalziel et al., 2018). A 10-nél kevesebb (6 patkány) tranzit pontszámmal rendelkező patkányokat eltávolítottuk az elemzésből (2 CY, 2 SM, 2 SY), mivel korábban kimutatták, hogy az állatok ~ 10% -a jelentősen késleltetheti a gyomor ürülését, ami használhatatlan tranzitot eredményez. adatok (Dalziel et al., 2016).

Statisztikai elemzések

A patkányok étrendi bevitelének és súlyának összehasonlítását egyirányú ANOVA alkalmazásával elemeztük. A szórásokat (SD) szintén kiszámolták és beszámolták az átlagos bevitelről és a testtömeg-növekedésről. A PERMANOVA és a PERMDISP elemzéseket Calypso-val végeztük. A 0,05 alatti P értékeket szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Patkány étrendi bevitele és súlyai

Az ebben a vizsgálatban szereplő patkányokat szilárd tejmentes étrenddel etették, hogy eltávolítsák az étrend egyéb tejtermék-összetevőinek potenciálisan zavaró hatásait. Porított sovány tejet használtak, és a tejitalokat 3% fehérjére hígították a zsír- és fehérjebevitel kiegyenlítése érdekében.

Az összes kezelési csoportban a patkányok átlagos napi bevitele 27 ± 3,5 g (SD) szilárd táplálékot és testtömeg 19 ± 3,9% -kal (SD) nőtt 14 nap alatt (S3 kiegészítő táblázat) (Dalziel et al., 2018). Nem volt szignifikáns különbség a napi szilárd táplálékbevitel vagy a kezelési csoport súlya között a 0. vagy a 14. napon (S3 kiegészítő táblázat). A tejitalok esetében a CM csoportban (87,48 ml) volt a legalacsonyabb a napi átlagos bevitel, és a CY csoportban volt a legmagasabb (103,73 ml), de az összes csoport közötti beviteli különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (ANOVA, p = 0,07) (Kiegészítő táblázat S3).

A Cecal Microbiota különbözik a tejital-kezelések között

Annak megállapítására, hogy vannak-e különbségek a négy tejital-kezelési csoport között, a nagy áteresztőképességű szekvenálási adatokat elemezték a sokféleség, a közösség összetétele, a taxonómia és a metaadatokkal való összefüggések szempontjából. Az alfa diverzitás vizsgálatához meghatároztuk a Shannon-indexeket. Nem találtunk szignifikáns különbséget a kezelési csoportok között (S1. Kiegészítő ábra).

Ezután meghatároztuk a baktériumközösség összetételének különbségeit. A Bray-Curtis főkomponens-analízis (PCA) diagram nem mutatott egyértelmű különbséget a kezelési csoportok között, sokkal inkább egy gradiensszerű eloszlást mutatott, a tehéntej-kezeléssel, amely az egyes patkányok között a legnagyobb elterjedést mutatta (1. ábra). Annak megállapítására, hogy lehet-e szignifikáns különbség a csoportok között, PERMANOVA-t hajtottunk végre, amely különbséget javasolt a kezelési csoportok között (p 2. ábra. Menekültügyi szinten (2A ábra) a tehéntej (CM) csoport különösen megkülönböztetett volt a megnövekedett Actinobacteriumokkal és csökkent Bacteroidetes. A tejekben (CM, SM) hasonló mennyiségű Firmicutes volt, míg a joghurtokban (CY, SY) a Firmicutes és a Bacteroidetes összehasonlítható aránya volt. specifikus kezeléseknél (pl. magasabb Coriobacteriaceae CM-ben), valamint nem erjesztett és fermentált termékek között (pl. nagyobb tej Lactobacillaceae). A PERMDISP elemzés által megállapított, a közösségen belüli csoportok közötti variáció különbsége egyes kezelési csoportokban magasabb rendszertani variabilitást sugallt az egyes patkányok között. (pl. CM) (kevésbé egységes taxonómiai összetétel). Az egyes patkányok taxonómiai grafikonjai kiemelik ezeket a mintákat (Supplementar y S2 ábra).

A rendszert ábrázoló taxonómiai grafikonok (A) törzs és (B) az egyes tejital-kezelési csoportokban talált családi szintű baktériumközösségek (csoportátlag) [CM, tehéntej; CY, tehénjoghurt; SM, juhtej; SY, juhjoghurt].

A kezelési csoportok közötti taxonómiai bőségekben tapasztalható erőteljes és értelmes különbségek azonosítása érdekében az LEfSe használatát választottuk a taxonómiai csoportok azonosítására, amelyek jelentős különbségeket mutatnak a menedékjogtól az OTU-ig. A LEfSe 16 taxont azonosított jelentős változásokkal (3. ábra). Míg számos taxont azonosítottak, a taxonómiai összetétel grafikonokhoz hasonlóan, a CM tejital-kezelés egyértelműen egyedibb rendszertani ábrázolást mutatott. Különösen magas Collinsella aerofaciens (OTU6) (Collinsella, Coriobacteriaceae, Coriobacteriales, Coriobacteriia, Actinobacteria) és alacsonyabb Acidaminococcaceae (Selenomonadales, Negativicutes) mennyisége hiányzott a többi tejital-csoportból.

A taxonómiai csoportok oszlopdiagramja, amelyet az LEfSe elemzés jelez, a legnagyobb valószínűséggel a terméktípusok (tej és joghurt) közötti különbségek magyarázatára (5. ábra). Míg hat taxont azonosítottak szignifikánsan eltérőnek, az eltolódás nagy része egyetlen OTU-hoz köthető (C. aerofaciens, OTU6), ami a fajok eredetének kisebb hatását sugallja a teljes baktériumközösségre. Ezt a taxont azonosították a kezelési elemzések során, valamint a Collinsella nemzetséget a fermentációs állapot elemzésében, ami arra utal, hogy több tényező befolyásolja a bőségét.

A taxonómiai csoportok oszlopdiagramja, amelyet az LEfSe elemzés jelez, és amely valószínűleg a termék eredetének különbségeit magyarázza (tehén és juh) (p (10K, XLSX)