Az étrend által kiváltott metabolikus diszreguláció visszafordítása az étrend váltásával a máj megváltozásához vezet de novo lipogenezis és glicerin-lipid szintézis

Tárgyak

Absztrakt

Bevezetés

Ennek megoldásának módja annak vizsgálata, hogy a máj lipidjei hogyan változnak a glükóz intolerancia és az inzulinrezisztencia visszafordulását követően. A T2D-ben szenvedő embereknél egyértelmű, hogy a glikémiás kontroll gyorsan normalizálható akár bariatrikus műtét 20,21, akár nagyon alacsony energiatartalmú étrend 22,23,24,25,26 mellett, ennek nagy része a máj által közvetített 20,22,23, 24,26. A felelős mechanizmusok azonban nem egyértelműek. Míg a máj glükóz-anyagcseréjének javulása az energia korlátozására reagálva csökken a máj TAG 23 szintje, a bioaktív lipidekre, például a DAG-ra gyakorolt hatásokról keveset tudni, mivel az emberi májminták megszerzésének nehézségei vannak. Korábbi, 14 egereken végzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a máj inzulinrezisztencia a magas zsírtartalmú, magas szacharóztartalmú étrend (HFD) legkorábbi metabolikus megnyilvánulása, amely méhen kívüli lipidfelhalmozódással, de nem máj- vagy zsírszöveti gyulladással társult. E tanulmányok fényében átfogó elemzést kívántunk végezni a lipid- és glükóz-anyagcseréről olyan egerekben, amelyeknél akut váltás történt a HFD-ről a szokásos chow-étrendre, hogy jobban meghatározhassuk a máj lipid-anyagcseréje és a glükóz homeosztázis kapcsolatát.

Kísérleti eljárások

Dizájnt tanulni

A 42. napon 5 órás böjt után vért (

30 μL) kaptunk a farokvénából a glükóz, a plazma inzulin és az FFA meghatározásához. A glükózt (50 mg) orális szondán keresztül adtuk be, és a vért 15, 30, 45, 60, 90 és 120 percen keresztül vettük. A 63. napon stabil OGTT jelzésű izotópot 27 végeztek. Az izotóppal jelölt glükóz beadása biztosítja a dinamikus glükóz-elhelyezkedés, az endogén glükóztermelés (EGP) és a máj hiábavaló glükózciklusának értékelését 27. A glükózt glükózmérővel (Accu-Check, Roche, NSW, Ausztrália) és a plazma nyomjelzővel való dúsulást gázkromatográfia-tömegspektrometriával (GC – MS) mértük 27 .

Az EGP forrásainak meghatározása

A 64. napon 17:00 órakor az egerek 0,9% (w/v) NaCl-ot tartalmazó 2 H2O (30 ml/kg, Sigma, Castle Hill, NSW, Ausztrália) intraperitoneális injekciót kaptak. Az egereket egy éjszakán át 10% 2 H2O-val dúsított ivóvízzel tartottuk, amely testnedvdúsítást eredményezett

5%. Másnap reggel vér (

50 μl) 5 órás böjt után kaptunk a 2H testvíz jelölésének, valamint a 2H helybeli dúsulásának a plazma glükózban történő meghatározásához GC-MS segítségével, amely lehetővé teszi a glükoneogenezisből (GNG) és a glikogenolízisből előállított glükóz arányának megoldását 27,28 .

Lipid anyagcsere

A TAG-t kolorimetriás vizsgálattal (Triglycerides GPOPAP; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) határoztuk meg. A DAG-t és a ceramidot kivontuk

15 mg májat, a 29. részben leírtak szerint, és az LC-MS/MS módszerben részletesen elemezve, Weir et al. 30. Glicerin-lipid szintézis és de novo A lipogenezist (DNL) 2 H2O jelöléssel mértük. Pontosabban, a glicerolipid szintézist úgy határoztuk meg, hogy mértük a máj glicerin 31 csoportjának glicerid glicerin részébe 2H beépülését, míg a DNL értékét a 2 H beépülésének meghatározásával a teljes palmitát 32,33-ba. A palmitát jelölést használják a DNL mérésekhez, mivel ez az emlősök zsírsavszintáz reakciójának fő terméke, a lánc megnyúlásából eredő zsírsavak jelölése> 16 szénatomos, és nem a DNL 33,34. A lipidek extrahálása be van kapcsolva

15 mg előre lemért májszövetet hajtottunk végre a Folch 35 módszerei szerint [U-13 C] palmitát (Cambridge Isotopes) hozzáadásával belső standardként, amely lehetővé tette a teljes palmitát 35 számszerűsítését. A lipidfrakciót 3 N metanolos HCl (Sigma, Castle Hill, Ausztrália) hozzáadásával átészterizáltuk, és 60 ° C-on inkubáltuk 1 órán át. A glicerint Folch-extrakcióval 35 elválasztottuk a zsírsav-metil-észterektől (FAME). A glicerint tartalmazó vizes fázist szárítottuk és MTBSTFA + 1% t-BDMCS (Sigma-Aldrich) hozzáadásával derivatizáltuk, és a mintákat elektronionizációs GC-MS alkalmazásával elemeztük. Pontosabban, a molekuláris [M-57] ionjai m/z 377 és 378 elemzést végeztek SIM módban. A FAME-t tartalmazó lipidfrakciót megszárítottuk és hexánban újraszuszpendáltuk. A molekuláris ionjai m/z 270, 271 és 286 ([U-13C] palmitát belső standard) metil-palmitátot SIM-módban elemeztünk GC-MS-en keresztül. A glicerolipid szintézist és a DNL-t a prekurzor termék jelölési arányának egyenlete alapján számítottuk:

A termékcímkézés a 2 H glicerinben vagy palmitátban történő moláris dúsításának feleslegére utal, az előjelző jelölés = testvíz 2 H dúsítás (plazma) és n = a cserélhető hidrogénatomok száma, amelyet meghatároztunk

4,5 a máj-glicerid-glicerin 31 és

22 a máj palmitát esetében 32,33. A szintetizált termék abszolút mennyiségeit úgy számítottuk ki, hogy az újonnan előállított termék frakcióját megszoroztuk az abszolút termékkoncentrációval. A háttér izotóp bőség korrekcióját úgy hajtottuk végre, hogy kivontuk a 2 H2O-val kezelt minták dúsítását azokból az egérmájokból, amelyek nem voltak kitéve 2 H2O-nak.

Máj metabolitok

A metabolitokat kivontuk és elemeztük a GC-MS 36,37 módszerrel. A glikogént KOH-emésztésekben mértük, enzimatikus hidrolízisnek vetettük alá, majd a szabad glükozil-egységek mennyiségi meghatározását glükóz-oxidáz vizsgálattal.

Plazmaelemzés

A plazma inzulint és a leptint ELISA módszerrel mértük (Millipore, St Louis, MO, USA). A plazma FFA-kat spektrofotometriásán mértük enzimatikus kolorimetriás vizsgálattal (NEFA C készlet; Wako Chemicals, Richmond, VA, USA).

Statisztika

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Az adatokat elemezték egyirányú ANOVA-val vagy adott esetben kétirányú ismételt ANOVA-mérésekkel. Az egyirányú ANOVA esetében Newman-Keuls többszörös összehasonlító teszteket használtak a csoportok közötti különbségek megállapítására. Az ANOVA kétirányú ismételt méréseihez Holm-Sidak többszörös összehasonlító tesztjeit használták a csoportok közötti különbségek meghatározására. A statisztikai szignifikanciát p

Eredmények

Energiafelvétel és testtömeg

Az első 56 nap során a HFD és a HFD → CHOW csoportok több energiát fogyasztottak, mint a CHOW csoport (1A. Ábra). Az 57-től 65-ig (vagyis a diéta megfordítása) az energiafogyasztás csökkent a HFD → CHOW-ban (1A. Ábra). A testtömeg az alapvonalon nem volt különbözõ a csoportok között (1B. Ábra). Mindazonáltal mind a HFD, mind a HFD → CHOW csoportok nagyobb testtömeget nyertek, mint a CHOW egerek az 56 napos HFD periódus alatt. A 65. napon, 9 nappal az étrend megfordítása után a HFD → CHOW egerek lefogytak, de nem voltak lényegesen könnyebbek, mint a HFD egerek, és nehezebbek maradtak, mint a CHOW csoport (1B. Ábra). Az epididymális és a szubkután (1C, D ábra) zsírpárnák nehezebbek voltak HFD-ben a CHOW és HFD → CHOW egerekhez képest, míg a zsírpárnák tömege magas maradt HFD → CHOW-ban a CHOW csoporthoz képest (1C, D ábra). A plazma leptin hasonló mintát követett (1E. Ábra). Nem volt különbség a quadriceps tömegében a csoportok között (1F ábra), ami azt jelzi, hogy a HFD → CHOW egerekben a súlycsökkenés a zsírvesztésnek és nem az izomtömegnek tulajdonítható.

Az étrend hatása az energiafogyasztásra és a testtömegre.

Glükóz anyagcsere

Az étrend hatása a glükóz toleranciára.

A diéta hatása az endogén glükózra, a glükóz ártalmatlanítására és az EGP forrásaira.

Máj metabolitok

Célzott profilozást végeztek a metabolitok elemzésére a glikolitikus/GNG útvonalban, valamint a TCA ciklusban (4A. Ábra). A glikolitikus metabolitok, a glükóz-6-foszfát (G6P), a fruktóz-6-foszfát (F6P), a glicerin-3-foszfát (G3P) és a foszfenol-piruvát (PEP), valamint a glikolitikusan nyert aminosav szerin mind csökkentek a HFD egerekben ( 4A. Ábra). A HFD az adenozin-monofoszfát (AMP; 4B. Ábra) csökkenését okozta, ami a máj energiaszintjének emelkedését jelzi. Ezek a metabolitok vagy részben (G6P, F6P, PEP és AMP), vagy teljesen helyreálltak (G3P és szerin) a CHOW egerek májában talált szintre, miután átálltak a HFD-ről a chow-ra (4A. Ábra). A glicinben, ribulóz-5-foszfátban (Ru5P), ribóz-5-foszfátban (R5P), laktátban vagy alaninban (4A. Ábra) nem találtunk különbséget. A citrát csökkent a HFD csoportban mind a CHOW, mind a HFD → CHOW csoportokhoz képest (4B. Ábra), míg a fumarát és a malát a HFD → CHOW egerekben megemelkedett a CHOW és HFD csoportokhoz képest (4B. Ábra). A szukcinát, a glutamát és az aszpartát nem különbözött a csoportok között (4B. Ábra). Ahogy az várható volt, a máj szabad glükózkoncentrációja (4A. Ábra) tükrözte az éhomi glükózkoncentrációét (2D. Ábra) oly módon, hogy a HFD egerekben megemelkedett, és az étrendi váltást követően a CHOW csoportéhoz normalizálódott.

A máj metabolikus profilozása.

Máj lipid anyagcsere

A HFD a máj TAG és DAG növekedését okozta (5A., B ábra). A chow-étrendre való áttérés csökkentette a TAG és a DAG-t a HFD → CHOW egerekben, így azok statisztikailag nem különböztek a CHOW csoportéitól (5A, B ábra). Bár a TAG és a DAG statisztikailag nem különbözött egymástól, azok továbbra is

Kétszer magasabb az étrend megfordítási csoportjában a CHOW-hoz képest (5A. Ábra, B). Ezenkívül számos DAG faj növekedett a HFD egerekben (4B. Ábra), miközben erős tendencia volt, hogy ezeket csökkenteni kell a chow étrendre való áttéréssel. A teljes ceramidot az étrend nem változtatta meg (5C. Ábra), de az egyes fajokra gyakorolt hatásokat úgy találták, hogy a HFD növelte a ceramid 20: 0 arányát, míg a 24: 1 arányú ceramid csökkent (5.C ábra). Érdekes, hogy a ceramid 18: 0, 20: 0 és 22: 0 emelkedett a HFD → CHOW csoportban, összehasonlítva a CHOW egerekkel (5.C ábra). A HFD → CHOW egerekben a máj lipidjeinek csökkenéséért felelős mechanizmusok vizsgálatához 2 H2O jelöléssel értékeltük a máj glicerin-lipid szintézisét és a DNL-t. Az újonnan szintetizált glicerin-lipid abszolút mennyisége magasabb volt a HFD csoportban, összehasonlítva a HFD → CHOW és CHOW csoportokkal (5D. Ábra). A HFD egerekben a teljes májpalmitátszint megemelkedett, míg a CHOW részben normalizált májpalmitáttartalomra váltott (5E. Ábra). Az újonnan szintetizált palmitát (DNL) abszolút mennyisége nem különbözött a CHOW és a HFD csoportok között (5F. Ábra). A DNL azonban alacsonyabb volt a HFD → CHOW egerekben, mint a CHOW és HFD csoportokban (5F ábra).

Az étrend hatása a máj lipidanyagcseréjére.

Vita

Megmutattuk, hogy az önkéntes energia bevitel gyors csökkenése annak eredményeként, hogy a HFD egerek visszaváltják a chow étrendet, csak 7 nap múlva teljesen normalizálja a glükóz intoleranciát, az éhomi hiperglikémiát és a hiperinsulinémiát. Érdekes módon, mint az embereknél 20, 22, 23, 24, 26, ez akkor is bekövetkezett, ha a testtömeg és a zsírpárna tömege csak mérsékelten csökkent. Sőt, annak ellenére, hogy az étrend megfordító egerekben gyorsan javult a glükóz homeosztázis, a máj lipidjei nem normalizálódtak teljesen, és

Kétszer magasabb, mint a CHOW csoporté. Ezek a megállapítások együttesen arra utalnak, hogy a megnövekedett zsírbetegség és az emelkedett májzsírszint nem feltétlenül járul hozzá az inzulinrezisztens és a glükóz-intoleráns állapot fenntartásához, és hogy az energiaegyensúly akut változásai valószínűleg fontosabb szerepet játszanak a glükóz homeosztázis modulálásában.

2 H2O 39 jelölést is alkalmaztunk a GNG és a glikogenolízis EGP-hez való hozzájárulásának vizsgálatára. Bár a HFD egerek éhomi hiperglikémiát és glükóz intoleranciát mutattak, a GNG-re és a glikogenolízisre való támaszkodás nem változott. Ezenkívül ezeket a fluxusokat nem befolyásolta az étrend megfordításának egere. Bár ezek az eredmények váratlannak tűnhetnek, a GNG frakcionális vagy abszolút arányának emelkedése csak súlyos hiperglikémiás, inzulinhiányos betegeknél tapasztalható, áttekintésért lásd: 39. Ezért nem meglepő, hogy a HFD egerekben a GNG nem emelkedett, mivel ezek nem nyíltan T2D és inzulinopénikusak, inkább a pre-diabétesz modellje, amelyet inzulinrezisztencia és hiperinsulinémia jellemez 2. Összhangban korábbi eredményeinkkel 27 és mások 40-es eredményeivel, megmutatjuk, hogy a GNG teszi ki

Az EGP 80% -a akutan éhomi egerekben, tükrözve ezen állatok rendkívül magas anyagcseréjét 2. Így a széles körben elterjedt véleménnyel ellentétben a HFD egerekben nem növekszik a GNG-re való támaszkodás, és tekintettel arra, hogy mi 14 és mások 41 azt mutattuk, hogy a zsírtal táplált rágcsálóknál a bazális EGP nem emelkedik, a GNG abszolút aránya nem egy HFD.

Az egereken végzett korábbi vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a HFD egerekben a glükóz homeosztázis teljes vagy csaknem teljes ad libitum chow étrend 42,43,44. Fontos azonban kiemelni, hogy ezek a tanulmányok hosszabb távú étrend-megfordítási periódusokat használtak, két hét és négy hónap között 42,43,44,45. Érdekes módon csak egy vizsgálat végzett bármilyen szervspecifikus biokémiai mérést 43. Li et al. 43 azt találta, hogy 20 hétig HFD-vel táplált egerekben három hét CHOW-etetés javította a glükóz toleranciát, és a máj TAG és DAG szinte teljes normalizálódását okozta. Ezzel szemben azt tapasztaltuk, hogy a máj TAG és DAG értéke csökkent

50% a HFD-ről CHOW-ra váltáskor. Bár a TAG és a DAG tartalma statisztikailag nem különbözött a CHOW és az étrend megfordítási csoportjai között, szintjük megmaradt

2-szer magasabb. A vizsgálatok közötti eltérések valószínűleg annak tulajdoníthatók, hogy a jelenlegi vizsgálatban alkalmazott étrend-megfordítási időszak rövidebb volt, mint a Li által alkalmazott et al. 43 (azaz 9 nap vs. 3 hét). Mindazonáltal annak ellenére, hogy a máj TAG és DAG csak részben normalizálódott az étrend megfordításával, a glükóz homeosztázis teljesen helyreállt. Ez arra utal, hogy a máj glicerolipidjei és a glükóz homeosztázis közötti kapcsolat bonyolult, és nem lineáris, hanem lehet olyan küszöb, amelynél a TAG és a DAG magasabb szintje rontja a szisztémás glükóz anyagcserét.

Korábbi 14,27 eredményeinkkel összhangban a HFD-vel nem figyeltünk meg változást a máj teljes ceramidtartalmában. Érdekes módon az egyes fajok elemzése után nyilvánvalóvá vált, hogy a HFD a ceramid 20: 0 növekedését okozta, míg a ceramid 24: 1 aránya csökkent. Meglepetésünkre a ceramid 18: 0, 20: 0 és 22: 0 emelkedett volt az étrend megfordító egerekben, összehasonlítva a CHOW csoporthoz. Így, ellentétben a máj TAG és DAG esetében észlelt egységes változásokkal, kevés összefüggést találunk a máj ceramidja és a glükóz homeosztázis, az adipozitás vagy a máj steatosis között, ami összhangban áll mások megállapításával 46 .

Noha általánosan elfogadott, hogy az elhízott embereknél megemelkedik a plazma FFA, fontos kiemelni, hogy ez nem mindig így van, ahogy Karpe áttekintette. et al. 47. Összhangban korábbi munkáinkkal (27,48) és másokkal 49-es egerekben és patkányokban (41,50,51,52), azt tapasztaltuk, hogy a HFD-vel táplált elhízott egerek következetesen Alsó a plazma FFA szintje, mint a sovány chow kontrolloké. Valószínű magyarázat erre az, hogy a HFD-vel táplált állatoknak nagyobb a hatékonysága a szöveti zsírsavfelvételben 50. Ezenkívül, amint azt itt bemutattuk, a HFD-vel táplált egerek májában a glicerin-lipid szintézis sebessége is drámai módon növekszik, ami azt jelzi, hogy a plazma FFA-k gyorsan észtereződnek és raktározódnak, ezáltal csökkentve azok koncentrációját.

Váratlan megállapítás az volt, hogy az étrend megfordításának egerekben a plazma FFA koncentrációja megegyezett a HFD csoportéval (azaz alacsonyabb, mint a CHOW). Ennek oka csak akkor vált nyilvánvalóvá, ha meghatározták a máj lipid fluxusait. A glicerolipid szintézis jelentősen megemelkedett a HFD egerekben, összehasonlítva mind a CHOW, mind a reverz csoportokkal, magyarázva ezekben az állatokban a TAG és a DAG növekedését, és jelezve a magas zsírsavészterezés mértékét. Annak ellenére, hogy az étrend megfordításának egerei drámai, de nem teljes mértékben csökkentették a máj TAG és DAG szintjét, a glicerolipid szintézis, bár az egyirányú ANOVA-val nem érte el a statisztikai szignifikanciát, matematikailag nőtt (

Összefoglalva, megmutatjuk, hogy a krónikusan magas zsírtartalmú, magas szacharóz tartalmú egerek, miután visszaváltják a chow alapú étrendet, önként csökkentik energiafogyasztásukat, ami 7 napon belül teljes normalizálódást eredményez a glükóz anyagcserében. Érdekes módon ez az adipozitás és a máj lipidkoncentrációjának részleges csökkenésével járt, jelezve, hogy az elhízás és a lipotoxicitás önmagában nem feltétlenül tartják fenn a glükóz-intoleráns és inzulinrezisztens állapotot a HFD-vel táplált egerekben. Inkább a tartós táplálkozás a fő tényező, amely felelős a glükóz anyagcsere hibáinak előidézéséért. Ezenkívül feltárjuk, hogy az étrend megfordítása során a máj komplex anyagcsere-adaptáción megy keresztül, amely a fokozott zsírsav-újraészterezéssel szemben a DNL csökkenését vonja maga után, amely mechanizmus valószínűleg lehetővé teszi a máj lipidjeinek nettó veszteségét, miközben megakadályozza a Az FFA koncentrációja az adipozitás gyors elvesztése miatt.

további információ

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Kowalski, G. M. et al. Az étrend által kiváltott metabolikus diszreguláció visszafordítása az étrend váltásával a máj megváltozásához vezet de novo lipogenezis és glicerin-lipid szintézis. Sci. ismétlés. 6., 27541; doi: 10.1038/srep27541 (2016).