Az étrend okozta alkoholmentes steatohepatitis egérmodelljei reprodukálják az emberi betegség heterogenitását

Gasztroenterológiai tagozat, Orvostudományi Osztály, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, Amerikai Egyesült Államok, Gasztroenterológiai Osztály, Hospital de Santa Maria, CHLN, Lisszabon, Portugália

Gasztroenterológiai tagsági osztály, Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, Amerikai Egyesült Államok

Endokrinológiai tagsági osztály, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, Amerikai Egyesült Államok

Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, Amerikai Egyesült Államok Patológiai tagsági osztálya

Gasztroenterológiai tagsági osztály, Orvostudományi Tanszék, Duke University Medical Center, Durham, NC 27710, Amerikai Egyesült Államok

Mariana Verdelho Machado,
Gregory Alexander Michelotti,
Guanhua Xie,
Thiago Pereira de Almeida,
Jerome Boursier,
Brittany Bohnic,
Cynthia D. Guy,
Anna Mae Diehl

Javítás

2015. június 29 .: Machado MV, Michelotti GA, Xie G, de Almeida TP, Boursier J és mtsai. (2015) Javítás: Az étrend által kiváltott alkoholmentes steatohepatitis egérmodelljei reprodukálják az emberi betegség heterogenitását. PLOS ONE 10 (6): e0132315. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132315 Nézet javítása

Ábrák

Absztrakt

Háttér és célok

Az alkoholmentes steatohepatitis (NASH), a nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) potenciálisan progresszív formája, korunk pandémiás májbetegsége. Bár a NASH számos állatmodellje létezik, az optimális modell tekintetében nincs egyetértés. Célul tűztük ki a NASH jellemzőinek összehasonlítását a két legelterjedtebb egérmodellben: metionin-kolinhiányos (MCD) étrendben és nyugati étrendben.

Mód

Az egereket szokásos chow-val, 8 hétig MCD-diétával vagy nyugati diétával (45% zsírtartalmú energia, túlnyomórészt telített zsír, 0,2% koleszterin, plusz fruktózzal és glükózzal kiegészített ivóvíz) tápláltuk 16 hétig. Összehasonlították a máj patológiáját és az anyagcsere profilját.

Eredmények

Az emberi NASH-val összefüggő anyagcsere-profilt jobban utánozta a nyugati étrend. Bár a máj steatosis (azaz a triglicerid felhalmozódása) is súlyosabb volt, a máj nem észterezett zsírsavtartalma alacsonyabb volt, mint az MCD diétás csoportban. A nyugati étrend-modellben a NASH kevésbé volt súlyos és kevésbé reprodukálható, amit a kevesebb májsejt-halál/apoptózis, gyulladás, duktuláris reakció és fibrózis is bizonyít. Az emberi NASH patogenezisében/progressziójában szerepet játszó különféle mechanizmusok szintén kevésbé voltak robusztusak a nyugati étrend modelljében, ideértve az oxidatív stresszt, az ER stresszt, az autofágia deregulációját és a hedgehog út aktiválását.

Következtetés

Az egerek etetése egy nyugati étrenddel metabolikus zavarokat modellez, amelyek az enyhe NASH-ban szenvedő embereknél általánosak, míg az MCD-diéta beadása jobban modellezi azokat a patobiológiai mechanizmusokat, amelyek az emberi NAFLD előrehaladott NASH-ba történő előrehaladását okozzák.

Idézet: Machado MV, Michelotti GA, Xie G, de Almeida TP, Boursier J, Bohnic B és mtsai. (2015) A diéta által kiváltott alkoholmentes steatohepatitis egérmodelljei reprodukálják az emberi betegség heterogenitását. PLoS ONE 10 (5): e0127991. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0127991

Akadémiai szerkesztő: Silvia C. Sookoian, A Lanari-IDIM, Buenos Aires-i Egyetem - Nemzeti Tudományos és Technológiai Kutatási Tanács (CONICET), ARGENTINA

Fogadott: 2015. március 13 .; Elfogadott: 2015. április 22 .; Közzétett: 2015. május 27

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a kutatást az NIH DK0077794 és a DK053792 (Diehl AM), valamint a Duke Endowment: A firenzei McAlister professzor (Diehl AM) támogatja. Az MVM PhD-támogatást kapott a Fundação para a Ciência e Tecnologia-tól (FCT, Portugália). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmány megtervezésében, a gyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) a nyugati társadalomban a leggyakoribb májbetegség [1]. Becslések szerint egymilliárd alany rendelkezik NAFLD-vel világszerte [2]. Bár a betegek többségének jóindulatú evolúciója lesz, akár 25% -uknál potenciálisan progresszív májkárosodás alakul ki, amelyet alkoholmentes steatohepatitisnek (NASH) neveznek. A NASH-t májsejtek sérülése/halála, gyulladása és a májfibrózis és a karcinogenezis fokozott kockázata jellemzi [3]. A NAFLD/NASH a májtranszplantáció harmadik vezető javallata az Egyesült Államokban, és a hepatocelluláris karcinóma okozta májtranszplantáció második oka [4].

Habár a harminc évvel ezelőtti első leírások óta sokat tanultak a NAFLD-ről, még mindig óriási hiányosságok vannak a patogenezisével, a prognózissal, a megelőzéssel és a kezeléssel kapcsolatban. Az emberi NAFLD tanulmányozását akadályozza az a tény, hogy az olyan körülmények spektrumát öleli fel, amelyeket nem invazív módon nehéz megkülönböztetni. Ezenkívül a NAFLD egy nagyon lassan progresszív betegség, amely akadályozza a prospektív megfigyelési vizsgálatokat. E kihívásokra való tekintettel szükség van az emberi patológiát utánzó állatmodellekre. A tökéletes állatmodell kifejlesztené a NAFLD-t az emberi állapot kulcsfontosságú kockázati tényezőinek (azaz az elhízásnak és a metabolikus szindrómának, SM) összefüggésében, végül nyilvánvalóvá tenné a NASH összes szövettani jellemzőjét, előrehaladhat előrehaladott májfibrózisra, és hajlamos lehet a májsejtes karcinómára. . Fontos, hogy az ideális NASH modellnek kevés időre és ráfordításra van szüksége a fejlesztéshez/fenntartáshoz, és nagyon reprodukálhatónak kell lennie. A NAFLD/NASH étrend által kiváltott modelljei kis állatokban vannak. Az egerek általában előnyösek rövid élettartamuk és a feltételezett patogén/védő utak genetikai manipulálásának könnyűsége miatt.

A NAFLD/NASH kiváltására a legszélesebb körben alkalmazott étrend a metionin-kolin hiányos (MCD) étrend. A szokásos MCD étrend magas szacharóztartalommal rendelkezik (az energia 40% -a), és mérsékelten zsírral dúsított (10–20%). Ez egy nagyon reprodukálható modell, 8 hét beadás után következetesen indukálja a súlyos NASH fenotípusát [5]. Az MCD-étrendet azért kritizálták, mert súlycsökkenést okoz, és nem váltja ki az SM jellemzőit, ami a NAFLD fontos kockázati tényezője [6]. A magas zsírtartalmú étrend egy másik magasan tanulmányozott megközelítés a NAFLD fejlesztésére. Az ilyen étrendek heterogenitása megnehezíti a különböző kutatócsoportok tanulmányainak összehasonlítását. A szokásos magas zsírtartalmú étrend azonban általában nem vált ki jelentős NASH-t (azaz májsejtek pusztulását, gyulladását vagy fibrózisát), még akkor sem, ha 28 hétnél tovább táplálják, annak ellenére, hogy reprodukálhatóan provokálja az elhízást, az SM-t és a máj steatosisát [7]. A közelmúltban módosított, magas zsírtartalmú étrendet alkalmaztak a NAFLD/NASH modellezéséhez. Ez az étrend telített zsírsavakkal gazdagodik, és koleszterinnel, valamint magas fruktóztartalmú kukoricaszirup-ekvivalensekkel egészíti ki, utánozva a „nyugati étrendet” jellemző gyorséttermi stílust [8]. A nyugati étrend előnye, hogy elhízást és SM-t vált ki egerekben, bár hosszú távú alkalmazást igényel.

Ebben a tanulmányban fej-fej-összehasonlítást hajtottunk végre az MCD és a nyugati étrend között, miután több olyan változót kontrolláltunk, amelyek befolyásolják az anyagcserét és a NAFLD patogenezisét: egér genetikai hátterét, életkorát, nemét és az állatok közötti létesítményekkel kapcsolatos különbségeket a fény- sötét kerékpározás és őshonos mikrobiális flóra. Az eredmények fontos diéta által kiváltott különbségeket azonosítanak, amelyek megmagyarázhatják, hogy a két étrend miért modellezi a NAFLD patogenezisének különböző szakaszait.

Mód

Állatkísérletek

A vad laboratóriumi (WT) hím C57Bl/6 egereket a Jackson Laboratóriumtól szereztük be, és bármelyik chow-étrendet etettük (Picolab Rodent diet 20, # 5053; n = 13 egér); MCD-diéta (MP Biomedicals, # 960439; n = 15 egér) 8 hétig, vagy nyugati étrend (TD.120330 22% HVO + 0,2% koleszterin-diéta, Teklad Research, magas kukoricacukor-fruktóz-szirup-ekvivalensekkel kiegészítve az ivóvízben, azaz 42 g/l glükóz és fruktóz, 55% és 45%, w/w; n = 8 egér) 16 héten keresztül. A diéták jellemzőit az S1 és S2 táblázatok foglalják össze. A beavatkozásokat 12 hetes korban kezdték az MCD diéta és 4 hetes nyugati étrend esetében, annak érdekében, hogy minden egérben 20 hetes korban teljesítsék a protokollt. Az állatgondozást és az eljárásokat a Duke Egyetem Intézményi Állattartás hagyta jóvá, és teljesítette a Nemzeti Egészségügyi Intézet és a Duke University IACUC humánus állatgondozásra vonatkozó követelményeit.

Emberi minták

A májtranszplantált donorok májbiopsziáit (n = 5) és enyhe fibrózisban (F0-1) (n = 5) vagy súlyos fibrózisban (F3-4) (n = 5) felnőtt NASH betegek véletlenszerűen választották ki a Duke University Health System NAFLD-ből Klinikai adatbázis és biorepository. A betegek a felvételkor megalapozott beleegyezést adtak. Ezen elemzés előtt a betegek nyilvántartását anonimizálták és azonosították. A tanulmányokat a Duke IRB hagyta jóvá, és azokat a Nemzeti Egészségügyi Intézet és az emberi tárgy kutatásának intézményi irányelvei szerint hajtották végre.

Szövettani elemzés

A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott májszakaszokat H&E-vel festették, és képzett patológus értékelte a NAFLD súlyosságát Brunt és mtsai. [9]. Az immunhisztokémiát a korábban leírtak szerint végeztük az S3 táblázatban meghatározott antitestekkel [10]. A májfibrózist Picrosirius vörös (# 365548, Sigma) festéssel értékeltük [10]. A TUNEL festést (11684817910, Roche) a gyártó javaslatai szerint végeztük.

Szérum- és szövetanalízis

A májenzimeket az Állatorvosi Diagnosztikai Laboratórium, a Duke University Medical Center laboratóriumi állati erőforrások osztálya vizsgálta. Az inzulint ultraibens érzékeny egér inzulin ELISA készlettel (Crystal Chem Inc.: # 90080) mértük; a lipideket a szérumban és a májban mértük triglicerid kolorimetriás vizsgálati készlettel (Cayman Chemical Company: # 10010303), szabad zsírsav-kvantifikációs készlettel (Abcam, ab65341) és koleszterin-kvantifikációs készlettel (Abcam, ab65359); a szérum leptint és az adiponektint Abcam egér ELISA készlettel határoztuk meg, ab100718, illetve ab108785. A máj hidroxiprolin tartalmát a korábban leírtak szerint számszerűsítettük [11].

Molekuláris vizsgálatok

mRNS mennyiségi meghatározása valós idejű reverz transzkripció-PCR (RT-PCR) segítségével.

A teljes RNS-t a májból TRIzol (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk. Az RNS-t reverz átírással cDNS-sablonokba alkalmaztuk primer és Super Script RNSse H-reverz transzkriptáz (Invitrogen) felhasználásával, majd amplifikáltuk. A szemikvantitatív qRT-PCR-t iQ-SYBR Green Supermix (Bio-Rad) és StepOne Plus Real-Time PCR Platform (ABI/Life Technologies) alkalmazásával hajtottuk végre, az előzőekben leírtak szerint [12]. Az alapozókról lásd az S4 táblázatot.

Western Blotting.

A teljes fehérjét RIPA pufferrel (Sigma) extraháltuk a teljes májból. A fehérjéket elektroforézissel választottuk el 4% -20% Criterion géleken (BioRad), polivinilidén-difluorid membránokba transzblotáltuk és az S5 táblázatban felsorolt primer antitestekkel inkubáltuk.

Statisztika

Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A szignifikanciát Kruskal-Wallis és Mann-Whitney tesztek segítségével állapítottuk meg, szignifikancia p 1. ábra. Az MCD diéta és a nyugati étrend hatása az anyagcsere profiljára.

A WT egereket chow-diétával, 8 hétig MCD-diétával vagy 16 hétig nyugati diétával etették, és 20 hetes korukban feláldozták őket. (A). Testtömegek; (B). Adipokinek (leptin és adiponektin); (C). Az éhomi szérum glükóz és HOMA-IR index; (D). Szérum trigliceridek és nem észterezett zsírsavak (NEFA-k). Az átlag ± SEM eredményeket ábrázoljuk. * 2. ábra. Az MCD étrend és a nyugati étrend hatása a máj steatosisára és a májenzimekre.

(A). Máj/testtömeg (LBW) arány, szérum-aminotranszferázok (ALT, AST) és lúgos foszfatáz (ALP) egerekből táplált egerekkel, MCD-vel vagy nyugati étrenddel. (B). Reprezentatív májszakaszok H&E festése egerekből (bal oldali panelek) és enyhe vagy súlyos fibrózisban szenvedő NASH betegekből (jobb oldali panelek). (C). Olajvörös O festés az egerek reprezentatív májszakaszainak (bal oldali panelek) és a máj lipidszintjének (jobb). (D). qRT-PCR elemzés a lipid metabolikus enzimeket kódoló májgénekről. Az eredményeket a chow-diet táplált egerekre normalizáltuk és átlag ± SEM-ként ábrázoltuk. * 3. ábra. Az MCD diéta és a nyugati étrend hatása a májfibrózisra és a ductularis reakcióra.

(A). Máj hidroxil-prolin tartalma és qRT-PCR elemzés a májfibrózisban és a progenitor marker génekben; (B). A fibroduktuláris reakció markereinek (Sirius vörös, α-SMA, dezmin, K19 és Sox-9) (bal oldali panelek) és a megfelelő morfometriának (jobbra) festett reprezentatív egerek májszakaszai. Az eredményeket a chow-táplált egerekre normalizáltuk és átlag ± SEM-ként ábrázoltuk. * 4. ábra. Az MCD diéta és a nyugati étrend hatása a májsejtek pusztulására, gyulladására és oxidatív stresszére.