Elhízott zebrafish: Kicsi hal az emberi egészség egyik fő állapotára

Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország

Nők a hepatológiai csoportban, Modena, Olaszország

Országos Gasztroenterológiai Intézet, „S. de Bellis ”kutatókórház, Castellana Grotte, Olaszország

Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország

Nők a hepatológiai csoportban, Modena, Olaszország

Belgyógyászati Klinika, Endokrinológiai Osztály, Parma, Parma, Olaszország

Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország

Nők a hepatológiai csoportban, Modena, Olaszország

Levelezés

Erica Villa, Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország.

Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország

Nők a hepatológiai csoportban, Modena, Olaszország

Országos Gasztroenterológiai Intézet, „S. de Bellis ”kutatókórház, Castellana Grotte, Olaszország

Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország

Nők a hepatológiai csoportban, Modena, Olaszország

Belgyógyászati Klinika, Endokrinológiai Osztály, Parma, Parma, Olaszország

Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország

Nők a hepatológiai csoportban, Modena, Olaszország

Levelezés

Erica Villa, Belgyógyászati Klinika, Gasztroenterológiai osztály, Modenai Egyetem és Reggio Emilia, Modena, Olaszország.

Absztrakt

1. BEMUTATKOZÁS

Számos metabolikus tanulmány kimutatta, hogy az elhízással kapcsolatos társbetegségek kialakulásának előrejelzésében a zsír regionális eloszlása a testben relevánsabb, mint a testzsír teljes mennyisége. 13., 14. Különösen a zsigeri zsírszövet mennyisége (VAT) és a zsír méhen kívüli lerakódása kritikusan korrelál a kardiovaszkuláris és anyagcserezavarok kialakulásának megnövekedett kockázatával. Ezeket az elhízással kapcsolatos rendellenességeket általában metabolikus szindrómának nevezik, és az elhízás eseteinek többségében jelen vannak. 15 Az elhízott betegeknél a megnövekedett AT által felszabaduló plazma szabad zsírsavak (FFA-k) fontos kapcsolatot alkotnak az elhízás és a metabolikus szindróma között. 16 A FFA-k fokozottabb máj- és izomfluxusa elősegíti a lipotoxicitást, megváltoztatja az inzulin működését és alkoholmentes zsírmájbetegséghez (NAFLD) vezet, amely a májszövet változásainak spektruma a steatosistól az alkoholmentes steatohepatitisig (NASH), cirrhosisig és hepatocellularisig carcinoma. 4

2 A ZEBRAFISHI LÁRVÁBAN AZ ABBESZTUS VIZSGÁLATÁNAK IN VIVO MEGKÖZELÍTÉSE

2.1 Lipidfestés

Annak érdekében, hogy jobban megértsük az elhízás okozta változásokat a szervezet fiziológiájában, a zebrafish modell felhasználható az adipogenezis eredetének felkutatására, a petesejt megtermékenyítéstől a lárva állapotáig. Az emlősöknél az AT két fő osztálya van: a barna zsírszövet (BAT), amely eloszlatja az energiát és hőt termel, valamint a fehér zsírszövet (WAT), amelyet energiatárolásra és az energiaegyensúly szabályozására terveztek. Sajnos a fejlődésükben és a szabályozásukban résztvevő mechanizmusok még mindig nem tisztázottak 20, részben az AT képalkotásával kapcsolatos nehézségek miatt, emlős modellrendszerekben, különösen a korai életszakaszban.

Az anya testén kívül fejlődő és optikailag átlátszó zebrafish lárvák alkalmas eszközök a lipidtranszport mikroszkópos és biokémiai vizsgálatára, valamint a lipidfelvétel, -szállítás és -elhelyezés hibáinak szűrésére. Valóban, a lipid anyagcserét, az elhízást, a szív- és érrendszeri károsodásokat és az anyagcsere betegségeket alaposan tanulmányozták ebben a modellben. 17, 21 A zebrafish rendelkezik minden speciális sejttípussal, amely részt vesz a lipidek felszívódásában és feldolgozásában (pl. Bél enterociták, zsírraktározó adipociták, máj májsejtek és hasnyálmirigy acináris sejtek). 22, 23 Az adipociták különféle színezékekkel vizualizálhatók a zebrafish lárvák kifejlesztésében, például a sudanofil olaj Red O (ORO), a szudáni, a Nile Red vagy a Lipid Green festékekben. 24 A zsírsav mobilizáció és transzport értékeléséhez a lipofil BODIPY ® fluorofort alkalmazzák: ha a zebrafish sárgájába injektálják, 3 órán belül gyorsan diffundál a keringési rendszerbe. 25

A zebrafish lárvák a megtermékenyítést követő 5-6 napon belül kezdenek enni (dpf); ebben az időszakban felszívják az esszenciális zsírban oldódó vitaminokat, a triacil-glicerint (TAG) és a koleszterint, amelyet anyai eredetű sárgás zsák nyújt. Az 5 dpf lárva stádiumában a lipidek számos szövetben vannak jelen, beleértve a hepatocitákban való kisebb felhalmozódást is. Az adipogenezis első jelei 8 dpf-nál válnak láthatóvá a hasnyálmirigyhez közeli zsigeriüregben. Az adipociták a hasnyálmirigyben 12 dpf lárvában is megjelennek. 26.

Nílusvörös festéssel az adipociták 15 dpf-nél jól láthatók a zsigeri régióban (intraabdominális és környező belső szervek), 20 olyan lokalizációval, amely embereknél társul, és a T2DM kialakulásának kedvezőtlenebb kockázati tényezői vannak. 27, 28 Az adipociták száma a lárvák méretével, nem pedig az életkorral van összefüggésben, ami arra utal, hogy a test hosszúságától függ a lipidek adipocitákban való tárolása. Míg 17 dpf-nél az összes lárva WAT-t tartalmaz a hasnyálmirigy és a zsigeri területen, 20–22 dpf-nél méretfüggő módon szubkután (SL> 8,2 mm) és agyi (SL> 9,4 mm) adipociták alakulnak ki. 29.

A lipidfestés lehetővé teszi az étrendi lipidfelszívódás nyomon követését a zsírtartalmú folyadéktáplálási protokoll alapján zebrafish lárvákban: 1 órás inkubálás után 4% -os zsíroldatban (erős tejszínhab) az elülső bél és 6 dpf lárva szegmensközi edényei erős festést mutatott ORO-val. Az ORO festés szintjének növekedése korrelált az egész lárva TAG-jával.

2.2 In situ hibridizáció és elhízás mRNS markerei

Egy nemrégiben készült tanulmány először jelentette, hogy a SOX6 transzkripciós faktor az adipogenezis aktivátoraként működik a PPARG és mezoderm-specifikus transzkriptum (MEST), közvetlenül kötődve a promótereikhez. Az SOX6 alapvető funkciói az adipogenezisben konzerválódnak az emberek és más gerincesek között, amint azt a zebrafish sox6 homozigóta nullmutáns lárvái in vivo mutatják. Ezek a megállapítások fontos lépést jelentenek az emberi elhízás magzati eredetének és annak születés utáni fejlődésének hipotetikus közvetlen szerepének vizsgálatában. 41

2.3 Génmanipuláció a génexpresszió követésére in vivo

A zebrafish egyik fő előnye a génexpresszió manipulálásának egyszerűsége és hatékonysága. A mutáns és transzgén halak, amelyekben a génexpresszió szabályozatlan, lehetővé teszik az in vivo vizsgálatokat a betegségekben részt vevő útvonal molekuláris szintjén. Ezenkívül a transzgénikus zebrafish lárvák specifikus sejttípusokban expresszálhatják a fluoreszcens fehérjéket, amelyek aztán könnyen detektálhatók az átlátszó lárvákban, lehetővé téve az elhízás fejlődésének és progressziójának nyomon követését. Ezenkívül az 5 dpf-ig terjedő zebrafish embriókra és lárvákra nem vonatkoznak ugyanazok a szabályozási követelmények, mint a felnőtt emlősökre, ami növeli ennek a nagy áteresztőképességű eszköznek az értékét.

Transzgének (1. táblázat) felhasználásával, pl. Zebrafish Tg (hPPARγ‐EGFP) 42 beépítve a zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) a kérdéses gén szabályozási ellenőrzése alatt, lehetőség van az élő szövetek monitorozására és a specifikus gyógyszerhatások vizsgálatára. Egy érdekes tanulmány, amelyet ebben a modellben végeztek, tesztelte azon vegyi anyagok obesogén potenciálját, amelyeknek naponta ki vagyunk téve a környezetünkben, értékelve a lipid felhalmozódást és annak összefüggését az aktiválóképességükkel PPARG zebrafish lárvákban. 43

Tg(-2.8fabp10a: gfp ‐ gank)

Tg(-2.8fabp10a: HBV.HBx-GFP)

Tg (-2.8fabp10a: EGFP-yy1b)

A máj zsírsavkötő fehérje (L ‐ FABP) lehetővé teszi a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) májspecifikus expresszióját

Gankyrin (gank)

Hepatitis B vírus X fehérje

Mindenütt előforduló transzkripciós faktor Yin Yang 1 (YY1)

Kifejezésük módosítása képes máj steatózist indukálni a zebrafish-ban

A közelmúltban számos tanulmány számolt be arról, hogy a makrofágok kulcsszerepet játszanak a zsírszövet gyulladásában. Különböző érintett molekulákat azonosítanak, de a mögöttes mechanizmus továbbra is tisztázatlan. A zebrafish makrofág riporter sor Tg (lyz: Ds Red) zebrakon a makrofágok zsírszövetbe való beszivárgásának tanulmányozására. 44. C lizozim (LysC) expresszióról beszámoltak, amely kifejezetten jelzi a makrofág rekeszt a lárvák sárgáján. A fluoreszcens riportereken alapuló tanulmányok segítenék a tudósokat abban, hogy in vivo monitorozás segítségével tisztázzák a gyulladásos aktivációs mechanizmusokat és az egészséges és a patológiás zsírszövet átalakulását előidéző folyamatokat.

Az elhízás az egyetlen legjelentősebb rizikófaktor a steatosis kialakulásában, és a zebrafish lárvák steatosis alakulnak ki. A steatosis előfordulása és mértéke súlyosabb volt a koleszterint (HFC) tartalmazó, magas zsírtartalmú étrenddel etetett halaknál. A máj lipid felhalmozódása a lárvákban növeli a HFC-modell megbízhatóságát a potenciális steatosis elleni gyógyszerek szűrésében. 45

A zebrafish lárvák másik előnye, hogy morfolinók (MO-k) alkalmazásával a génexpresszió átmeneti leütését hozzák létre, 46 ami lehetővé teszi a génfunkció gyors és hatékony tanulmányozását. Ez azonban csak a fejlődés korai szakaszára korlátozódik. Például az MO-ApoC2-vel (Apolipoprotein C2) injektált lárvák felszívatlan sárgája fenotípust mutatnak. A zebrafish-ban alkalmazott reverz genetika eredményeként megállapították, hogy az apoC2, amely szükséges az emberek lipoprotein-összeszereléséhez, elengedhetetlen a zebrafish-lárvák fejlődésében. 47 Az éhezésre és az újratáplálásra adott zsírmobilizációt zebrafish lárvákon is tanulmányozták. Megfigyelték, hogy amikor a halakat 4 napig éheztették, a semleges lipidraktárak minden helyen csökkentek, amíg az összes zsíranyag fel nem oldódott az éhezés 7. napján. A 4 napos újratöltés elegendő volt ahhoz, hogy a semleges lipidraktárakat az éhezés előtti helyeken helyreállítsák. 24 Ezek a megfigyelések összhangban vannak az emberre vonatkozó adatokkal.

A zebrafish transzgenikus biolumineszcencia riporter Tg (pck1: Luc2) a metabolikusan aktív gyógyszerek azonosítására szolgál a glükoneogenezis folyamatában, válaszként az „éhgyomorra táplálkozás” átmenetre. A citoszolos foszfoenol-piruvát-karboxikináz (PCK1) promóter akkor indukálódik, ha alacsony az étrendi szénhidráttartalom. Fehérje katalizálja a máj és a vese glükoneogenezisének szabályozási lépését. PCK1 a transzkripció táplálkozási körülmények között inzulinkontroll alatt, éhgyomorra glükagon, glükokortikoid és adrenalin kontroll alatt áll. 48 Ezek a modellek további vizsgálatokhoz használhatók, és különösen fontosak lesznek az étkezési rendellenességek és az egészségtelen étrend ebben a korában.

3 DIÉTA-INDUKTÁLIS TÖBBFÉNYMODEL FELNŐTT ZEBRAFISH-ban

További állandó jellemző mindkét modellben az elhízás és a zsírmáj kialakulásának rendkívül magas penetranciája volt. Ez ellentétben áll a rágcsáló modellekkel, amelyekben a kezelt állatoknak csak a töredéke alakította ki ezeket a körülményeket. 53, 54 Érdekes, hogy a zebrahalakat étkezési rendszerben etették, amely nagyon hasonlít az emberi táplálkozási szokásokhoz. Hasonló megközelítést javasoltak rágcsálóknál is, de a tápanyag-összetételben, az energiasűrűségben, az állagban és az ízben változó étrendek alkalmazása következetlen adatokra vezetett, lényeges különbségekkel a kísérleti állatok között. Az elhízás csak akkor alakult ki következetesen, ha nappali és éjszakai ételeket biztosítottak folyamatosan. 55

Az étrend által kiváltott elhízás zebrafish modelljeiből származó májszövet mikroszkópos elemzése egy olyan génexpressziós mintát tár fel, amely hasonlít az emberi NAFLD-re. 56 A zebrafish és az emlős VAT DNS-mikroszkópos elemzésének összehasonlítása során kiderült, hogy a véralvadásban, a vérlemezke-aktivációban és a lipid-anyagcserében részt vevő gének jelentősen dereguláltak az elhízott zebrafish-ban és emlősökben (egér, patkány és ember). Ezenkívül a diéta által kiváltott elhízás a zebrafish-ban a kalória-korlátozásra és a természetes vegyületekkel (zöld tea, Campari paradicsom, resveratrol) történő kezelésre reagál azáltal, hogy csökkenti a BMI-t és módosítja az elhízással kapcsolatos gének expresszióját. 57-59

A közelmúltban létrehozták a T2DM zebrafish modelljét. A hiperglikémiás étrend által kiváltott elhízási modell kidolgozásához a halakat nagyobb mennyiségű kereskedelmi táplálékkal etették. Kalóriát tekintve minden túletelt állat 408 kalóriát kapott naponta, szemben az Oka és mtsai által használt 150 kalóriával/nap. 49 Ez a rend nagyon gyorsan képes kiváltani a BMI-t, a zsírszövet térfogatát és a plazma trigliceridet, valamint csökkent glükóz toleranciát, megnövekedett inzulintermelést és megnövekedett β-sejt tömeget, összhangban a T2DM inzulinrezisztencia modelljével. Figyelemre méltó, hogy a T2DM ez a modellje reagál az antidiabetikus gyógyszerekre (metformin és glimepirid), és az emberi betegséghez hasonló transzkripciós útvonalakkal rendelkezik. 69

Az étrend okozta elhízás összes idézett modellje a zebrafish-ban felveti annak lehetőségét, hogy ezt az állatot felhasználva tanulmányozzák az elhízás és az elhízással összefüggő betegségek kialakulását egy olyan rendszerben, amely hasonlít az emberi/emlős patológiára. Sajnos a zebrafish-ban történő általános alkalmazásra vonatkozó szabványosított étrend még nem készült el. 70 Amint azt a 2. táblázat ismerteti, eddig több étrendet alkalmaztak kalóriában, zsírtartalomban és összetételben. A tápanyag-összetételükben változó étrendek különbségeket okoznak az energia bevitelében, a testösszetételben és az AT lerakódásában. A változó étrendből eredő komplikációk mellett a tartási körülmények is befolyásolhatják az energiafelhasználást és ennek következtében a kalóriaegyensúlyt. 55, 70