Az édesgyökér gyökérkiegészítése javítja az étrend okozta súlygyarapodást, a lipidlerakódást és a máj steatosisát petefészek-eltávolított egerekben anélkül, hogy stimulálná a reproduktív szöveteket és az emlőmirigyet

Zeynep Madak Erdogan

1 Botanikai Kutatóközpont, Élelmiszertudományi és emberi táplálkozási tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Ping Gong

2 Molekuláris és Integratív Élettani Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Yiru Chen Zhao

2 Molekuláris és integratív élettani tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Liwen Xu

2 Molekuláris és integratív élettani tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Kinga U. Wrobel

1 Botanikai Kutatóközpont, Élelmiszertudományi és emberi táplálkozási tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

James A. Hartman

1 Botanikai Kutatóközpont, Élelmiszertudományi és Emberi Táplálkozási Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Michelle Wang

1 Botanikai Kutatóközpont, Élelmiszertudományi és Emberi Táplálkozási Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Anthony Cam

1 Botanikai Kutatóközpont, Élelmiszertudományi és emberi táplálkozási tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Urszula T. Iwaniec

4 Csontvázbiológiai laboratórium, Biológiai és Népegészségügyi Tudományok Iskola, Oregoni Állami Egyetem, Corvallis, OR 97331, USA

Russell T. Turner

4 Csontvázbiológiai laboratórium, Biológiai és Népegészségügyi Tudományok Iskola, Oregoni Állami Egyetem, Corvallis, OR 97331, USA

Nathan C. Twaddle

5 Nemzeti Toxikológiai Kutatóközpont, Jefferson, AR 72079, USA

Daniel R. Doerge

5 Nemzeti Toxikológiai Kutatóközpont, Jefferson, AR 72079, USA

Ikhlas A. Khan

6 Nemzeti Természeti Kutatási Központ, Gyógyszerészeti Iskola, Mississippi Egyetem, Egyetem, MS 38677, USA

Mississippi Egyetem, University of Mississippi, University of Mississippi, Farmakognózia Tanszék BioMolecular Sciences Tanszék, MS, 38677, USA

John A. Katzenellenbogen

3 Kémiai Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Benita S. Katzenellenbogen

2 Molekuláris és integratív élettani tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

William G. Helferich

1 Botanikai Kutatóközpont, Élelmiszertudományi és Emberi Táplálkozási Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801

Absztrakt

Hatály

Megvizsgáltuk az édesgyökér-összetevők étrend-kiegészítésének hatását az étrend okozta elhízásra, a zsír felhalmozódására és a máj steatosisára ovariectomizált C57BL/6 egerekben, mint menopauza modell.

Anyagok és metódusok

Megvizsgáltuk az ovariectomizált C57BL/6 egereknek gyökérpor (LRP), kivonatok (LRE) vagy izolált izoliquiritegenin (ILQ) formájában beadott étrendi édesgyökér gyökér molekuláris és fiziológiai hatásait a reproduktív (méh és emlőmirigy) és nem reproduktív szövetekre. az anyagcsere szabályozása (máj, perigonadal, perirenal, mesentericus és szubkután zsír). A mennyiségi eredményméréseket, beleértve a testtömeget, a zsíreloszlást (MRI), az élelmiszer-fogyasztást, a csontsűrűséget és a súlyt (DXA), valamint a génexpressziót, a premenopauzális állapot helyreállításának mértékével értékeltük. Jellemeztük e szövetek szövettani (H&E és olajvörös O festése) és molekuláris tulajdonságait (bizonyos betegség markerek expressziója), és korreláltuk ezeket az anyagcsere fenotípussal, valamint a bioaktív anyagok vérszintjével.

Következtetések

Bár az LRE és az ILQ némi előnyt nyújtott, az ovariectomiát követően az LRP volt a leghatékonyabb a testtömeg-gyarapodás, a teljes zsírlerakódás, a máj steatosis és a máj lipidszintézis génjeinek expressziójának csökkentésében. Adataink azt mutatják, hogy az édesgyökér gyökere több metabolikus paraméter javulását eredményezte a menopauzás alacsony ösztrogénszintű és a magas zsírtartalmú étrend körülményei között a reproduktív szövetek stimulálása nélkül.

1. Bemutatkozás

Az elhízáshoz és a cukorbetegséghez kapcsolódó megnövekedett szív- és érrendszeri betegségekkel (CVD) összefüggő halálozások miatt ez a triász az Egyesült Államok egyik legnagyobb közegészségügyi problémája és a nők körében a morbiditás első számú oka [1]. A premenopauzás nőknél a cukorbetegség és a CVD kockázata a férfiak fele, de a menopauza után a metabolikus betegségek és a CVD előfordulása megduplázódik a nőknél, és végül eléri a férfiakét [1]. A menopauza idején csökkenő ösztrogénszint mellett nő a hasi zsír, az inzulinrezisztencia és a CVD kockázati tényezői [2–4]. Az ülő életmód, a mozgáskorlátozottság, valamint a nyugati stílusú, zsír- és cukorban gazdag étrend, alacsony ösztrogénekkel kombinálva a menopauza utáni nőknél, súlyosbítja ezt a problémát, és a posztmenopauzás nők hajlamosabbá válnak a metabolikus szindrómára és a kapcsolódó cukorbetegségre és CVD-re [2, 5, 6].

A szója- és szója-izoflavonok továbbra is a legszélesebb körben alkalmazott botanikai ösztrogének (BE), és bár számottevő kutatások tárgyát képezték, cselekedeteik körül még mindig vita van [9, 11, 13–16]. A szója mellett az édesgyökér gyökerét tartalmazó botanikus étrend-kiegészítőket olyan nők szedik, akik meg akarják őrizni egészségüket és enyhíteni akarják a menopauza tüneteit. Mindezek a növényi anyagok köztudottan ösztrogén aktivitású vegyületeket tartalmaznak, de a szójához hasonlóan ezek a vegyületek szerkezetileg is nagyon különböznek a HRT-ben található szteroid ösztrogéntől, és így valószínűleg mechanikailag eltérő hatást fejtenek ki. Az édesgyökér gyökér, amelyről korábban kimutattuk, hogy izoliquiritigenint tartalmaz, alacsony affinitású ösztrogénként hat az ERα-n keresztül [17, 18]. Az édesgyökér a flavone liquiritigenint (LIQ) tartalmazza, amely dinamikus egyensúlyban van az izomer kalkon-izoliquiritigeninnel (ILQ) [19]. Munkánkból [18] és mások munkájából [19] a prenilflavonoidok fő célpontjai valószínűleg az ER-k, bár ERβ-preferenciájuk kisebb, mint a szója-izoflavonoké [18], ami más mechanizmusok bevonására utal.

(A) Hipotézis a preferenciális BE-cselekvéshez a nem reproduktív szövetekben és a reproduktív szövetekben. (B) A tanulmány megtervezése. A C57BL6 egereket (8/csoport) 2 hétig vagy AIN76A kontroll étrendet (normál, alacsony zsírtartalmú étrend, 16% Kcal zsírból) vagy magas zsírtartalmú étrendet (HFD, 45% Kcal zsírból) táplálták, majd áttértek az édesgyökér botanikai (kontroll), az édesgyökér gyökér por (LRP), az édesgyökér gyökér kivonat (LRE) vagy az izoliquiritigenin (ILQ) 5 hétig a szövet- és vérvizsgálatok előtt

2. Anyagok és módszerek

2.1 Állatok és étrend

A menopauza utáni elhízásra és anyagcsere-egészségre való rugalmasságra gyakorolt hatásának teszteléséhez ovariektomizált C57BL/6 egereket használtunk, amelyek magas zsírtartalmú étrendet kaptak, és összehasonlítottuk a paramétereket a kontroll étrendben lévő állatoknál is. Ez egy általánosan alkalmazott módszer a menopauzával járó metabolikus betegség kiváltására egerekben [21–23]. Mivel a normál chow általában izoflavonokat tartalmaz, amelyek ösztrogén aktivitással bírhatnak, amelyek eltörölhetik az ovariectomia metabolikus hatásait, ezért fitoösztrogénmentes, félig tisztított AIN76A (Harlan, CA.170481) étrendet használtunk, amelynek kazein volt a fehérje forrása. A magas zsírtartalmú étrendet ezeknek a vizsgálatoknak (Harlan TD.88137) „nyugati étrendnek” nevezik, és az AIN76A étrenden alapul (zsírból 45% Kcal). Magas a vajzsír cukorral és némi koleszterinnel (0,2%), és metabolikus vizsgálatokra fejlesztették ki [21, 22]. A nagyon magas zsírtartalmú étrendet (zsírból 60% Kcal) nem használták az elhízás kiváltására, mert az USA-ban az emberek által elfogyasztott zsír összehasonlítható szintjét szerettük volna tanulmányozni (

34% Kcal zsírból; NHANES). Ezekhez a vizsgálatokhoz 8–10 hetes petefészek-eltávolított nőstény állatokat használtunk, akiket randomizáltak normál és magas zsírtartalmú étrendre plusz különféle BE-k kiegészítve az ételben, és több héten keresztül figyelték őket.

2.2 A BE-k és az adagok beadása

Az ezekben a vizsgálatokban használt összes BE-t a Mississippi Egyetem Botanikai Központja biztosította. Az összes botanikai komponens azonosságát és tisztaságát kromatográfiával és spektroszkópiával ellenõrizte ugyanaz a csoport, ahogy azt az elõzõ vizsgálatok elvégezték [18]. A BE-ket laboratóriumi állatoknak pelletált AIN76-alapú rágcsáló-étrenden keresztül adtuk be, amelybe az édesgyökér-gyökér komponenseket porok, szárított metanol-kivonatok vagy fő aktív komponensek formájában építették be. Mivel az ágyakat az emberek porként, kivonatként és frakcionált termékként fogyasztják, úgy gondoljuk, hogy ennek a megközelítésnek reális képet kell nyújtania arról, hogy milyen hatások várhatók az emberekben. A BE adása az élelmiszerekben is nagyon praktikus, és pelletált takarmánnyal számszerűsíthetnénk az élelmiszer-fogyasztást. Tapasztalataink szerint az állatok napi adagolása szondával gyakran stresszhez és csökkent élelmiszer-fogyasztáshoz vezet, ami komolyan megzavarja a kísérleti eredményeket, ezért nem használták.

2.3 Az édesgyökér gyökér összetevőinek azonosítása a vérben

A LIQ és az ILQ belső dozimetriáját felnőtt nőstény C57Bl/6 egerek szérumában értékeltük, amelyeket 5 hét múlva gyűjtöttünk össze az áldozat időpontjában a megfelelő étrenden. Validált LC/MS/MS módszer belső standard kvantifikációval (d3-daidzein és d4- genisteint a LIQ és ILQ esetében) alkalmaztuk a LIQ és ILQ teljes konjugált és aglikon formáinak számszerűsítésére (lásd 1. táblázat, kimutatási határok 0,0002–0,006 µM az elemzett térfogattól függően), enzimatikus hidrolízis nélkül, illetve n = 8 –10 egér). Az áldozatok időzítése az adagolt étrend utolsó fogyasztása tekintetében nem volt ismert, ezért az egypontos becslések jelentős bizonytalanságot tartalmaznak a maximális szérumkoncentrációval és az állatok közötti változékonysággal kapcsolatban.

Asztal 1

Az LIQ és az ILQ összkoncentrációja és aglikonjainak koncentrációja kontroll étrenden (C) vagy magas zsírtartalmú étrendben (HF) édesgyökér gyökérport (LRP), édesgyökér kivonatot (LRE) vagy tiszta izoliquiritigenint (ILQ) tartalmazó étrendben.

Hipotézisünk tesztelésére a 10 hetes petefészek eltávolított vad típusú C57BL6 egereket két étrend-csoportba osztottuk. Az étrendeket normál és magas zsírtartalmú formában is megfogalmazták, amelyek az embereknél gyakran tapasztalt étrendi stresszt jelentik. Az egyik csoport normál étrendet folytatott (AIN76A), míg a második csoportot 2 hétig magas zsírtartalmú étrendben tartották. A vivőanyag-kontroll és az E2-vel kezelt állatok (5 ug/nap; 0,125 mg E2-t tartalmazó pelletek) szubkután pelletet kaptak, míg a különféle édesgyökér-gyökér-komponensekkel kezelt állatok táplálékukban kiegészített BE-ket kaptak. A BE-k étrendi táplálása ésszerű megközelítés a BE-k étrend-kiegészítőként történő napi használatához, amelyet nők naponta egyszer vagy néhányszor pirulák formájában szednek.

Megállapítottuk, hogy a laboratóriumi állatok plazmájában lévő koncentrációk és a BEDS-t fogyasztó emberek koncentrációinak összehangolásával (ha ismert) a legjobban képesek vagyunk meghatározni a vizsgálatainkhoz megfelelő dózisokat. Általában a BE-ket az étrendben a gyökérpor 5 tömeg% -ának, a szárított metanol-kivonat 0,5% -ának vagy az extraktum főbb komponenseinek kisebb mennyiségében adják be (1B. Ábra). Ebben a formában az LRP biztosította a LIQ és az ILQ legmagasabb vérkoncentrációját mind teljes, mind aglikon formában (1. táblázat). Az 1. táblázat azt mutatja, hogy az LRP és LRE diéták hasonló szérumszintű LIQ és ILQ aglikonokat produkáltak az nM tartományban, a LIQ szintek következetesen magasabbak voltak, mint az ILQ, ami feltehetően tükrözi a flavanon/kalkon arányt G. uralensisben [27], valamint a ismert interkonverzió e két izomer anyag között [35]. A tisztított ILQ-t tartalmazó étrend ugyanabban a tartományban termelte az ILQ-szintet, mint az LRP és LRE étrend. A tisztított ILQ étrend fogyasztása mérhető LIQ szintet is eredményezett a szérumban, de ezek a szintek körülbelül tízszer alacsonyabbak voltak, mint az ILQ esetében. Az aglikonok az LRP és LRE diéták esetében a szérumban jelenlévő összes LIQ és ILQ 1% -át folyamatosan tartalmazták, ami összhangban áll a lenyelés utáni extenzív II. Fázisú anyagcserével.

Az édesgyökér (LR), mint por (LRP), kivonat (LRE) és tiszta izoliquiritigenin (ILQ) vizsgálatunkban azt találtuk, hogy az E2 és az LRP egyaránt hatékony volt a testsúly normalizálásában a kontroll és a nyugati (magas zsírtartalmú) étrenddel etetett állatokban (2A. Ábra), főként a teljes adipozitás változásai miatt (2B. Ábra), de nem a sovány tömegben (2C. Ábra), amelyet az egész test mágneses rezonancia képalkotása (MRI) igazolt. Ez az eredmény összhangban van az 1. táblázatban bemutatott bioaktív aglikon-formák vérszintjével, és arra utal, hogy ezek a különbségek valószínűleg az LRE vagy az ILQ magasabb dózisú étrendjében és esetleg hosszabb kezelési időknél is hangsúlyosabbá válnak.

(A) BE-kkel kiegészített különféle étrenden lévő állatok összsúlya. Kétirányú ANOVA, Bonferroni utóvizsgálat, * P 3. ábra). A magas zsírtartalmú étrendet folytató állatok kevesebb ételt fogyasztottak (3A. Ábra), ugyanakkor az energiafogyasztás hasonló volt (3B. Ábra). A várakozásoknak megfelelően az E2 csökkentette a táplálékfelvételt mind a normál, mind a magas zsírtartalmú étrendcsoportokban (3B. Ábra). Az édesgyökér-gyökér komponenst tartalmazó étrend azonban nem változtatta meg a táplálékfelvételt (3B. Ábra), jelezve, hogy ez nem volt meghatározó tényező az eltérő testtömeg és a zsírraktárak változásának szempontjából. Így vizsgálataink azt sugallják, hogy az édesgyökér gyökérzetéből származó BE-k nagyon hatékonyan normalizálják az ovariectomiával járó súlygyarapodást normál és magas zsírtartalmú étrend alatt, és a BE-k csökkentik az egerek zsírosodását normál és magas zsírtartalmú étrenden anélkül, hogy befolyásolnák a sovány tömeget.

(A) A BE-vel kiegészített különféle étrendű állatok méhének és több zsírraktárának súlya. (B) A BE-k nem indukálják az E2-re reagáló gének expresszióját a méhben vagy az emlőmirigyben. (C) A BE-k nem indukálják az emlőmirigy ductalis elágazását. (D) A BE-k nem befolyásolják a csonttömeget. Kétirányú ANOVA, Bonferroni utóvizsgálat, * P 5., 6. ábra). 6). Az ösztrogének eltávolítása petefészek eltávolítással, magas zsírtartalmú étrenddel kombinálva megnövelte a perigonadalis zsírszövet teljes adipozitását, és az E2-vel vagy LRP-vel végzett kezelés nagymértékben csökkentette az adipociták méretét, amint azt a H&E-vel festett szövetszakaszokban megfigyelték (5A. Ábra). Ezen markerek mellett az SCD1-t [38] és a FABP1-et is követtük a zsírszövetben [39]. Ezek a változások összhangban voltak a H&E festéssel, és az LRP és az LRE megelőző szerepét javasolták a zsírszövet által kiváltott magas zsírtartalmú zsírlerakódásban az adipocitákban. Az E2 és az édesgyökér gyökér komponensei (gyökérpor, kivonat vagy ILQ) modulálták a lipid-lerakódás szempontjából kritikus géneket.

(A) A magas zsírtartalmú étrendben lévő állatok perigonadal zsírszövetének szövettana, kontroll, E2, LRE, LRP vagy ILQ kiegészítéssel. (B) Különböző BE-kkel kiegészített, magas zsírtartalmú étrendben lévő állatok különböző zsírraktárainak génexpressziós elemzése. t-teszt, * P 6A. ábra) és olajvörös O festés (6B. ábra) a kezelt állatok májrészeiről. Ezenkívül a máj súlyát megnövelte a magas zsírtartalmú étrend, és ezt enyhítette az E2 és BE kezelések is (6C. Ábra). Ez a méhen kívüli lipidfelhalmozódás az alkoholmentes zsírmájbetegségre (NAFLD) vagy a máj steatózisára emlékeztet, amelyet elhízás és magas zsírtartalmú étrend vált ki emberekben és rágcsálókban [40–42], ami hajlamosítja az egyént a 2-es típusú cukorbetegségre és a szív- és érrendszeri betegségekre [ 43–45].

A májsteatózis két biomarkerének, a FASN-nek [46, 47] és az SREBP-1c [48, 49] monitorozásával igazoltuk a zsírsavszintézis útvonalainak molekuláris változását, és megállapítottuk, hogy E2 és LRP kezelésekkel csökkentek e gének expressziós szintjei (ábra (6D. Ábra) az ERα gátló szerepére utal ezen utak esetében. Annak bizonyítására, hogy az édesgyökér gyökérből származó BE-k az ERα-n keresztül működnek, olyan HepG2 sejteket kezeltünk, amelyek stabilan expresszálják az ERα vagy az egér elsődleges hepatocitáit, E2, ILQ vagy LIQ. Összességében az ILQ és a LIQ hatása kifejezettebb volt a HepG2-ERα sejtekben az elsődleges májsejtekhez képest. A ligandumokra adott válasz szintjének különbségei ellenére az ERα antagonista fulvestrant nagyon hatékonyan gátolta az S2BRE12 E2 és BE által történő szabályozását, ami arra utal, hogy a máj ERα-ján keresztül hatnak (6E. Ábra). Így vizsgálataink mechanisztikus alapot nyújtanak a szelektív BE-akciókhoz az ERα-n keresztül.

4. Megbeszélés

Kvantitatívan vizsgáltuk az édesgyökér-gyökér komponensek szövetszelektív hatásait morfológiai, fiziológiai és génszabályozási szinten. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az LRP táplálkozás az étrendben, amely az ILQ teljes koncentrációját és az aglikonokat biztosította, tükrözte az anyagcsere szövetekben az E2 hatását azáltal, hogy normalizálta az ovariectomia utáni súlygyarapodást, csökkentette a test teljes lipid-lerakódását és csökkentette a máj steatosisát az emlőmirigy stimulálása nélkül vagy a méh. Ezek a hatások az édesgyökér gyökér BE-nek a test zsírkomponensére gyakorolt hatása miatt voltak, és függetlenek az élelmiszer-bevitel változásától. Annak ellenére, hogy a BE-k étrendben történő BE-kiegészítése nem változtatta meg a táplálékfelvételt, a vizsgálat végén ezek az állatok kevesebb súlyt kaptak a kontroll állatokhoz képest.

Ezekből a BE táplálási kísérletekből és az azt követő elemzésekből nagy mennyiségű morfológiai, fiziológiai, biokémiai és génexpressziós adatot nyertünk, amelyekből felmérhetjük a különböző BE-k szövetszelektív hatásait az anyagcsere paraméterekre. Különösen megjegyeztük a BE-k potenciálját az egészséges anyagcsere-állapot fenntartására alacsony ösztrogénszint mellett (a menopauza modelljeként), és ugyanakkor a reproduktív szövetek stimulálásában kevés potenciális kockázatot figyeltünk meg. Az állatokon végzett BE-etetési vizsgálatok eredményei, a gén expressziós profilok és a különböző célszövetekben végzett útanalízisek, valamint a sejttenyésztési vizsgálatok az alapul szolgáló molekuláris mechanizmusok mechanisztikus aspektusait tárták fel, amelyek figyelembe vehetik az általunk megfigyelt szövetszelektív ERα mediált hatásokat. a BE-kkel.