Az étrendi korlátozás elnyomja a steatosishoz társuló máj tumorgenezist a hepatitis C vírusmag gén transzgénikus egerekben

Metabolikus Szabályozás Tanszék

elnyomja

Shinshu Egyetem Orvostudományi Kar

Asahi 3-1-1, Matsumoto 390-8621 (Japán)

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

Epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a túlzott zsírbetegség, a csökkent fizikai gyakorlatok és az egészségtelen étrend növeli a rákos megbetegedések kockázatát a különféle szervekben, különösen a májban [1, 2]. A hepatocelluláris carcinoma (HCC) az egyik leggyakoribb rosszindulatú daganat és a rákkal kapcsolatos halálozás egyik vezető oka világszerte [3]. A hepatitis B vírus vagy a hepatitis C vírus (HCV) tartós fertőzése, az etanolfogyasztás és a genetikai anyagcsere-rendellenességek, mint például a hemochromatosis, a Wilson-kór, a glikogén tárolási betegség és a citrinhiány a HCC konvencionális kockázati tényezői [4, 5]. A közelmúltban az elhízás és a metabolikus szindróma világszerte tapasztalható növekedése megnövelte az alkoholmentes zsírmájbetegségből (NAFLD) és az alkoholmentes steatohepatitisből (NASH) eredő HCC előfordulását [1–8], ami szoros kapcsolatra utal a túl táplálkozás és a máj tumorigenesis között.

Bár a máj steatosis elősegítheti a HCC kialakulását tartós gyulladás alatt az etanolbevitel és a hepatitis vírusfertőzés következtében, a NAFLD/NASH egyes esetekben nemcsak cirrhotikus májból, hanem nem-enyhe fibrózisú májból is okozhat HCC-t [6, 7]. A zsírsavak (FA) és köztes metabolitjaik májsejtekben történő felhalmozódása fokozhatja az oxidatív és endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt, valamint a lipidperoxidációt, ami mitokondriális diszfunkcióhoz, hepatocita károsodáshoz és DNS-mutációkhoz vezethet. A hepatocita degeneráció előrehaladtával a Kupffer-sejtek és a májcsillagsejtek aktiválódnak, a májgyulladás és a fibrózis fokozatosan előrehalad. A májsejtek integritásának és a hepatociták körüli mikrokörnyezet változásai elindítják és elősegítik a hepatociták rosszindulatú transzformációját, ami végül HCC-hez vezet [1, 2, 8, 9]. Ezért a napi életmód korrekcióját, valamint a hepatosteatosis és az adipozitás csillapítását előnyösnek tekintik a metabolikus szindrómával és a NAFLD/NASH-val társuló májdaganatképződés megelőzésében.

Az étrendi korlátozás (DR) az egyik ígéretes stratégia a máj steatosis és a szisztémás zsírosodás csökkentésére. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az étrendi energiafogyasztás krónikus, kb. 30% -os csökkentése jelentősen csökkentette az elhízott emberek és rágcsálók zsírtartalmát és javította az anyagcsere-profilját alultápláltság nélkül [10]. Pozitív összefüggést figyeltek meg az étrendi bevitel és az egerek kumulatív tumor előfordulása között [11]. Ezen megállapítások alapján kidolgozták azt a hipotézist, amely szerint a DR 30% -a képes csillapítani a steatosis eredetű HCC előfordulását. Az azonban továbbra sem tisztázott, hogy a DR valóban képes-e megakadályozni a steatosissal összefüggő máj tumorigenezist és pontos mechanizmusa.

Ezeknek a kérdéseknek a kezelésére a jelenlegi tanulmány egy olyan HCV maggén transzgénikus (HCVcpTg) egérvonalat használt, amely 2-3 hónapos korban spontán fejleszti az inzulinrezisztenciát, 8–9 hónapos korban a máj steatosisát és a hím egerek körülbelül 30% -ában hepatocelluláris tumorokat. 16-18 hónapos kor között, nyilvánvaló májgyulladás és fibrózis nélkül, hasonlít a NAFLD-hez társuló májdaganatképződés fenotípusára [12, 13]. Ezért a perzisztens DR hatását a szteatózissal összefüggő májdaganatképződésre úgy vizsgálták, hogy a HCVcpTg egerek táplálékának mennyiségét 30% -kal csökkentették 15 hónapon keresztül.

Anyagok és metódusok

Egerek és kezelés

Biokémiai elemzés

A szérum alanin-aminotranszferázt (ALT), az aszpartát-aminotranszferázt (AST), a trigliceridet (TG), az összes koleszterint (TC), a nem észterezett FA-t (NEFA) és a glükózt enzimvizsgálati készlettel (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japán). Az inzulin, az inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF1) és az adiponektin szérumkoncentrációit egér inzulin ELISA készlet (TMB; AKRIN-011T, Shibayagi, Gunma, Japán), egér/patkány IGF-1/IGF1 Quantikine ELISA készlet alkalmazásával határoztuk meg. (MG100, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), illetve egér/patkány adiponektin ELISA kit (Otsuka Pharmaceutical, Tokió, Japán). A máj összes lipidjét hexán: izopropanol módszerrel [18] extraháltuk, és azonos készletekkel (Wako Pure Chemical Industries Ltd) mértük. A máj hidroxiprolin koncentrációit a QuickZyme Hydroxyproline Assay kit (QuickZyme BioSciences, Leiden, Hollandia) segítségével mértük, másutt leírva [16, 17].

Szövettani elemzés

Minden egér kis darab májszövetét 10% -os pufferelt formalinban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A metszeteket (3 μm vastagságban) hematoxilinnal és eozinnal vagy Azan-Mallory módszerrel festettük [19, 20].

A 4-hidroxi-nonenal (4-HNE), a jelátalakító foszforilezett formáját és a 3. transzkripció aktivátorát (p-STAT3), valamint az extracelluláris szignál által szabályozott kinázt (p-ERK) expressziót immunhisztokémiai módszerekkel elemeztük. Az antigén visszakeresést mikrohullámú szöveti metszetekkel végeztük 10 mM Tris-HCl pufferben (pH 8,0), amely 1 mM EDTA-t tartalmazott 30 percig immunfestés céljából. A metszeteket 1 órán át inkubáltuk anti-4-HNE antitesttel (No. MHN-020P, JaICA, Shizuoka, Japán, 1: 5 hígítás), anti-p-STAT3 antitesttel (No. 9145, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA, 1: 100 hígítás) és anti-p-ERK antitest (4370. sz., Cell Signaling Technology, 1: 500 hígítás). A másodlagos antitestekhez a 4-HNE-hez tartozó Histofine mousestain-t és másoknak a Histofine Simple Stain MAX-PO®-ot használtuk, mindkettőt a Nichirei-től (Tokió, Japán) vásároltuk. Az immundetektáláshoz a peroxidáz aktivitást diaminobenzidin-hidrogén-peroxid oldattal vizualizáltuk. A primer antitestet elhagyó kontroll kísérletek során nem detektáltunk specifikus festést. A kóros diagnózist J. N., a Japán Patológiai Társaság igazolt patológusa és N. T. végezte el. független és elvakult módon.

Kvantitatív polimeráz láncreakció-elemzés

A teljes máj RNS-t NucleoSpin RNA Plus Kit (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Németország) alkalmazásával extraháltuk, és a cDNS-t reverz átírással ReverTra Ace® kvantitatív polimeráz láncreakcióval (qPCR) RT Master Mix (Toyobo, Oszaka, Japán) ). Az mRNS szintjeit SYBR qPCR kit (Toyobo) és az Applied Biosystems StepOne Plus valós idejű PCR rendszer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) alkalmazásával számszerűsítettük [16-22]. Minden lyukhoz egy mikroliter cDNS-alikvotot adunk. Az mRNS szinteket a 18S riboszomális RNS szintjére normalizáltuk, és a kontroll étrendet ad libitum táplált HCVcpTg egerekhez viszonyított változásokként fejeztük ki. A qPCR elemzéshez használt alapozó párokat az online kiegészítő 1. táblázat sorolja fel (az összes online kiegészítő anyagot lásd: www.karger.com/doi/10.1159/000508308).

Microarray elemzés

Immunblot elemzés

Statisztikai analízis

Az értékeket az átlag ± az átlag standard hibájaként (SEM) mutatjuk be. A kvantitatív és kvalitatív adatelemzést a kétfarkú hallgatóval végeztük t teszt, illetve χ 2 teszt, az SPSS statisztikai 22. verziójával (IBM, Armonk, NY, USA). A o érték