Az inzulinszerű növekedési faktor-1 az allergiás kontaktus szabályozó T-sejtek általi szuppresszióját indukálja

Absztrakt

Az allergiás kontakt dermatitist (ACD) az ártalmatlan kémiai vegyületekre adott rendellenes hipergyulladásos immunválasz váltja ki, és a világ leggyakoribb foglalkozási bőrbetegségének számít. Bár az ACD során számos immun effektor sejt aktiválódik, a szabályozó T (Treg) sejtek döntő fontosságúak a kialakuló gyulladás szabályozásában. Az inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1) szabályozza a sejtek szaporodását és differenciálódását, és felgyorsítja a sebgyógyulást és a regenerációt számos szervben, beleértve a bőrt is. A közelmúltban az IGF-1 szerepet játszik az autoimmun gyulladás elleni védelemben is a Treg sejtek terjeszkedésével. Itt bemutatjuk, hogy az IGF-1 méhen kívüli expressziója egér bőrében elnyomja az ACD-t Treg sejt-specifikus módon, növelve a Foxp3 + Treg sejtek számát az érintett területen és stimulálva a gyulladáscsökkentő citokin interleukin 10 limfocita termelését. terápiás hatások érhetők el az IGF-1 szisztémás vagy helyi adagolásával, ami ezt a növekedési faktort az ACD kezelésének ígéretes új terápiás lehetőségeként vonja maga után.

BEVEZETÉS

Az allergiás kontakt dermatitis (ACD) gyakori gyulladásos bőrbetegség, amelyet gyakran előforduló környezeti tényezők, például fémek, kozmetikumok, gyógyszerek és növényi anyagok expozíciója vált ki. Az ACD klinikai tünetei közé tartozik az erythema viszketése, vezikulák és hólyagok az akut fázisban, valamint repedések és repedések a krónikus fázisban (Usatine és Riojas, 2010). Az ACD jelentős társadalmi-gazdasági hatás mellett jelentős hatással lehet az érintett személyek életminőségére (Kimber et al., 2002; Ale és Maibacht, 2010). Az ACD molekuláris mechanizmusainak és patofiziológiájának ismerete főként kontakt túlérzékenységi (CHS) állatmodellekből származik, amelyekben a bőr gyulladását a haptennel, például 2,4-dinitrofluorbenzollal (DNFB) festve indukálják (Simonetta és Bourgeois, 2011 ). A CHS két lépésben fejlődik: indukció vagy szenzibilizáció és az azt követő kiváltási fázis. A szenzibilizációs lépésben a haptének behatolnak a bőrbe, és veleszületett immunválaszt indukálnak, amely a hapten-specifikus T-sejtek kiindulásához vezet, szenzibilizációt okozva, így a kezdeti haptenhez való bármilyen későbbi expozíció erőteljes másodlagos immunválaszt vált ki az érintkezés helyén. Emberben ez a bőr gyulladásos reakciójában csúcsosodik ki, amelyet klinikailag ACD-ként határoznak meg (Kimber és mtsai., 2002; Kaplan és mtsai., 2012; Vocanson és mtsai., 2009).

A szabályozó T (Treg) sejtek hatékonyan elnyomják a gyulladásos reakciókat, és kulcsfontosságúak az immunológiai homeosztázis és az ön tolerancia fenntartásában (Sakaguchi et al., 2010; Geiger és Tauro, 2012; Lehtimäki és Lahesmaa, 2013). A csökkent Treg-sejtek száma vagy az aberrált Treg-sejtek funkciói sokféle hipergyulladásos állapotban érintettek, és a Treg-sejtek számát helyreállító vagy növelő terápiák jótékony hatást mutattak a kísérleti körülmények között, valamint az emberi betegeknél is (Jäger és Kuchroo, 2010; Huang és Sattler, 2011). A Treg sejtek szintén fontos szerepet játszanak a gyulladásos válasz szabályozásában és feloldásában a CHS alatt. A Treg sejtek kimerülése fokozott és elhúzódó fülduzzanatot okoz (Tomura és mtsai., 2010), míg a Treg sejtek örökbefogadó transzferje elnyomhatja az immunsejtek beszivárgását és a fül duzzadását, ezt a hatást elsősorban az immunszuppresszív citokin interleukin (IL) felszabadulása közvetíti - 10 (Ring et al., 2009).

A peptid hormon inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1) a túlélés, a növekedés és a differenciálódás alapvető szabályozója, felgyorsítja a sebgyógyulást és fokozza a regenerációs folyamatokat számos szervben és szövetben, beleértve a bőrt is (Semenova et al., 2008). Az endokrin és az immunrendszer között gyakran alkalmazott keresztbeszédnek megfelelően az IGF-1 az autoimmun állapotokat is javítja (Liu et al., 1997; Lovett-Racke et al., 1998; Smith, 2010). Anguela és munkatársai arról számoltak be, hogy az IGF-1 protektív volt az autoimmun cukorbetegség során, korrelálva a máj megnövekedett Treg-sejt-százalékával (Anguela et al., 2013), és nemrégiben bebizonyítottuk, hogy a helyi Treg-sejtek proliferációját közvetlenül stimulálják szisztémás IGF-1. terápia többszörös autoimmun rendellenességekben (DB, BJ, NR et al., nem publikált).

Annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy az IGF-1 által közvetített Treg-sejtek expanziója nem autoimmun gyulladásos állapotokban is előnyös, CHS-t indukáltunk egerekben, amelyek vagy túlzottan expresszálták a bőrben lévő transzgénikus IGF-1Ea propeptidet (K14/IGF-1Ea), vagy pedig rekombináns humán IGF-1 (rhIGF-1) fehérje szisztémás vagy helyi alkalmazással a terápiás relevancia felmérése céljából. Dokumentáljuk a csökkent gyulladást a fül duzzanata, szövettan, citokin expresszió és Treg sejtek száma révén, és az IGF-1 receptor feltételes genetikai törlésével (IGF-1R) igazoljuk az IGF-1 Treg sejtekre gyakorolt közvetlen hatását. Az IGF-1 Treg sejtfüggő klinikai előnye ebben a modellben egyszerre nyújt mechanikus betekintést az ACD-be és klinikailag releváns stratégiát a terápiás alkalmazáshoz.

FORDÍTÁSI HATÁS

Klinikai kérdés

Az allergiás kontakt dermatitis (ACD) olyan gyulladásos bőrbetegség, amelyet olyan általános környezeti ágensekkel való érintkezés okoz, amelyekre az érintett egyén egy korábbi expozíció során érzékeny volt. Az ACD a világ legelterjedtebb foglalkozási bőrbetegségének számít, jelentős társadalmi-gazdasági hatással bír, és jelentősen befolyásolja az érintett egyének életminőségét. A klinikai tünetek közé tartozik a bőr viszketése bőrpírral (bőrpír), hólyagok és hólyagok az akut fázisban, valamint a bőr repedései és repedései a krónikus fázisban. Bár az ACD patológiájának hátterében álló pontos mechanizmusok továbbra sem tisztázottak, ismert, hogy számos immunsejt aktiválódik az ACD során, és az immunsejtek egy specifikus részhalmazának (a szabályozó T-sejtek) kudarca nem képes a kialakuló gyulladást ellenőrizni. a patológia. A közelmúltban az inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1) szerepet játszik abban, hogy a szabályozó T-sejtek stimulálása révén védelmet nyújt a hiper-gyulladásos állapotok más formáinak. Jelen tanulmány az ACD egér modelljével igyekezett meghatározni, hogy az IGF-1 hatékony-e a kontakt túlérzékenység (CHS) tüneteinek elnyomásában.

Eredmények

Az IGF-1 CHS tünetekre gyakorolt hatásának vizsgálatához transzgénikus egerekben CHS-t indukáltak, amelyek ektopikusan expresszáltatták az IGF-1-et a bőr sejtjeiben. Ezek az egerek a gyulladásos válasz és a klinikai CHS tünetek feltűnő csökkenését mutatták. Hasonló terápiás hatások érhetők el az IGF-1 szisztémás bejuttatásával implantált ozmotikus minipumpákkal vagy az érintett bőrfelület helyi kezelésével IGF-1 tartalmú hidrogéllel. A gyulladás elnyomása és az előnyös klinikai kimenetel összefüggésben van a szabályozó T-sejtek számának növekedésével és a gyulladáscsökkentő citokinek megnövekedett termelésével az érintett bőrfelületen. Ami a legfontosabb, hogy a CHS tüneteinek súlyossága azoknál az egereknél, amelyekből hiányzik az IGF-1 receptor, kifejezetten a szabályozó T-sejteken, nem javult az IGF-1 kezelés után. Ez erősen jelzi, hogy az IGF-1 jótékony hatásait a szabályozó T-sejtek közvetlen stimulálása közvetíti.

Következmények és jövőbeli irányok

Ez a tanulmány először mutatja be, hogy az IGF-1 közvetlenül stimulálja a szabályozó T-sejtek tágulását, és képes elnyomni a kóros gyulladásos reakciót kontakt túlérzékenység alatt. Ennek a tanulmánynak az eredményei ezt a növekedési tényezőt ígérik, mint egy ígéretes új terápiás lehetőséget az ACD kezelésében. Ezen túlmenően, az IGF-1 alkalmazása a szabályozó T-sejtek terjeszkedésére gyakorolt széleskörű hatása miatt terápiás potenciállal is bírhat más akut gyulladásos állapotban szenvedő betegeknél, ami további gyulladásos rendellenességek vizsgálatát indíthatja.

EREDMÉNYEK

Az IGF-1Ea propeptid túlzott mértékű expressziója a bőrben csökkenti az érintkezési túlérzékenységi válaszok súlyosságát

Az IGF-1R ablációja a Treg sejtekben megsemmisíti az IGF-1 terápiás hatását

Annak megvizsgálására, hogy a helyi IGF-1Ea propeptid megfigyelt szuppresszív hatása a CHS-re a bőrben közvetlen és Treg sejtektől függ-e, a K14/IGF-1Ea egereket kereszteztük Treg sejt-specifikus IGF-1R feltételes delécióval rendelkező egerekkel (IGF- 1R CKO: Foxp3 Cre × Igf1r fl/fl). Bár reprodukálható és statisztikailag szignifikáns, az IGF-1Ea szuppresszív hatásai csökkentnek tűntek ezekben az egerekben, valószínűleg a genetikai háttér különbségei miatt, amelyek különböző CHS indukciós dózisok használatát követelték meg ahhoz, hogy összehasonlítható fülduzzadási válaszokat kapjanak (kiegészítő anyag S2. Ábra). Érdekes módon az IGF-1Ea túlzott expressziójának az érintkezési túlérzékenységi válasz súlyosságára gyakorolt szignifikáns terápiás hatása elveszett az IGF-1R CKO egerekben, amelyek a vad típusú egerekhez hasonló CHS fülduzzadási reakciókat eredményeztek (3. ábra). Ezek az eredmények tehát azt bizonyítják, hogy a Treg sejtekben IGF-1R-közvetített jelzés szükséges az IGF-1Ea immunszuppresszív hatásához kontakt túlérzékenység alatt, és megerősítik, hogy ez a szabályozó sejtpopuláció szükséges az észlelt IGF-1-függő jótékony hatáshoz. akut gyulladásos válasz.

Kontakt túlérzékenység

Terápiás rhIGF-1 szállítási lehetőségek

Az rhIGF-1 szisztémás bejuttatását az rhIGF-1 (Cambridge Biosciences, Milpitas, CA) folyamatos felszabadításával érte el 0,25 μl/óra sebességgel egy Alzet ozmotikus minipumpa (modell # 2004, Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA) dózisban. 0,275 mg/kg/nap. A minipumpákat a hátsó bőr alatti bőrzsebbe ültették be altatásban. Az rhIGF-1-gyel végzett helyi kezelést 30 μl 100 μg/ml rhIGF-1 tartalmú hidrogél alkalmazásával hajtottuk végre egy fülön 3 nappal a CHS-válasz kiváltása előtt és 2 nappal azután.

Az immunsejtek izolálása a bőrtől

Az egér külső fülmagjait összegyűjtöttük, és hát- és hasi szórólapokra osztottuk szét. A szabványosított mintavétel és az azonos mintaméret biztosítása érdekében a fül fülét kivágtuk közvetlenül a külső fül porcterülete felett. A 2A. Ábra esetében a hátsó törzsből egy 2 cm 2 méretű bőrfelületet vágtunk ki. A bőr alatti szöveteket lekapartuk, a bőrt finomra vagdaltuk, és 0,25% -os kollagenáz F-vel (Sigma-Aldrich, Dorset, Egyesült Királyság) emésztettük 30 percig 37 ° C-on. Az emésztett szövetdarabokat ezután 70 μm-es szitán átszitáltuk egyetlen sejt-szuszpenzió létrehozása érdekében. A sejtkeveréket közvetlenül felhasználták a bőrbe beszivárgó sejtek áramlási citometriás elemzésére, vagy tovább dolgozták fel a CD45 + vagy CD4 + sejtek izolálására FACS rendezéssel. In vitro IGF-1 stimulációs kísérletekhez Foxp3EGFP egereket alkalmaztunk, és a CD4 populációt FACS-sorrendben CD4 + GFP + (összes CD4) és CD4 + GFP - (Treg sejt-depletált CD4) populációkba soroltuk. A FACS válogatást FACS Aria vagy FACS Aria SORP (Becton Dickinson, Oxford, Egyesült Királyság, 70 μm fúvóka, 70 psi;> 98% tisztaság) alkalmazásával hajtottuk végre.

Áramlási citometriás elemzés

Antitestek a CD45 (30-F11 klón), CD3 (17A2 klón), CD4 (GK1.5 klón), CD25 (PC61.5 klón), CD127 (A7R34 klón), Foxp3 (FJK-16F klón), Ki67 (16A8 klón) ellen. ), Az IL-10-et (JES5-16E3 klón) és a TGF-β-t (TW7-16B4 klón) a BioLegend-től (BioLegend, London, Egyesült Királyság) vásároltuk. A felületi és sejten belüli festéseket a gyártó protokollja szerint végeztük. A citokin festéshez a sejteket 4 órán át PMA/Ionomycinnel (Sigma-Aldrich, Dorset, Egyesült Királyság) inkubáltuk a GolgiStop (BD Biosciences, Oxford, Egyesült Királyság) jelenlétében a gyártók utasításai szerint. A potenciális Treg-sejtek bőrbe történő migrációjának nyomon követése érdekében a vérsejteket in situ CFSE-vel jelöltük meg úgy, hogy az egereknek 5 perc alatt 2 μg CFSE/10 μl/g testtömeget injektáltunk a farokvénán keresztül (Becker et al., 2004) . A mintákat egy BD LSRII (Becton Dickinson, Oxford, Egyesült Királyság) segítségével nyertük, és a FlowJo (Treestar, Ashland, OR) szoftverrel elemeztük. Az elemzéshez használt általános kapuzási stratégiát az S1.

Sejtkultúra

A fülbőrből vagy lépből izolált elsődleges immunsejteket 2 mM L-glutamint és 10% marha-magzati szérumot (Sigma-Aldrich, Dorset, Egyesült Királyság) tartalmazó 100 m/l RPMI-1640 táptalajban (Hyclone, Logan, UT, USA) tenyésztettük. ml sztreptomicin és 100 E/ml penicillin (Hyclone, Logan, UT) 37 ° C-on, 5% CO2-atmoszférában. Az IGF-1 kísérletekhez a sejteket rhIGF-1-gyel stimuláltuk 25 és 100 ng/ml koncentrációban 48 órán át, majd tovább dolgoztuk a Foxp3 expresszió áramlási citometriás festésére. A szaporodás kimutatására néhány kísérletben a sejteket a tenyésztés előtt eFluor780-mal (eBioscience, Hatfield, Egyesült Királyság) jelöltük a gyártó utasításainak megfelelően. Az intracelluláris citokin festéshez a sejteket 4 órán át stimuláltuk 50 ng/ml PMA-val és 500 ng/ml jonomicinnel (Sigma-Aldrich, Dorset, Egyesült Királyság) a GolgiStop (BD Biosciences, Oxford, Egyesült Királyság) jelenlétében a gyártók utasításai szerint. . Az ELISA alkalmazásához a sejteket 50 ng/ml PMA-val és 500 ng/ml jonomicinnel stimuláltuk 24 órán át.

ELISA

A CD45 + sejteket FACS-szortíroztuk a CHS-sel kezelt bőrről, és PMA-val és jonomicinnel stimuláltuk 24 órán át. Sejtkultúra-felülúszókat gyűjtöttünk és használtunk a szekretált IL-10 és TGF-β kimutatására. A LEGEND MAX ™ egér IL-10/TGF-β1 ELISA készleteket (BioLegend, London, Egyesült Királyság) a gyártó utasításainak megfelelően használtuk.

RNS izolálás és kvantitatív PCR

Az RNS-t izoláltuk CD45 + CD3 + CD4 + T-sejtekből, amelyeket FACS-válogatással nyertünk az F-emésztett kollagenáz F-emésztett hátsó bőr egysejtű szuszpenzióiból az RNeasy Mini Kit segítségével a gyártó utasításai szerint (Qiagen, Manchester, Egyesült Királyság). Teljes izolált RNS-t használtunk a cDNS-szintézishez SuperScript első szálú szintézis rendszer alkalmazásával RT-PCR-hez (Life Technologies, Monza, Olaszország) a gyártó utasításai szerint. A kvantitatív RNS-analízist valós idejű PCR-rel hajtottuk végre Taqman-próbákkal (Life Technologies, Monza, Olaszország) IL-10 és Foxp3 ellen. Az mRNS mennyiségét a hprt gén szintjére normalizáltuk, amelyet belső kontrollként használtunk.

Szövettan

CHS-sel kezelt és kezeletlen egerek fülfülét kivágtuk és 4% formaldehidben rögzítettük egy éjszakán át, növekvő gradiens etanolban dehidráltuk és paraffinba ágyazottuk. 5 μm-es metszeteket elvágunk, majd viaszmentesítjük és etanol-gradiensben rehidratáljuk. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük. Az összes reagenst a Sigma-Aldrich-től (Sigma-Aldrich, Dorset, Egyesült Királyság) szereztük be. A képeket LMD7000 mikroszkóppal (Leica Microsystems, Milton Keynes, Egyesült Királyság) rögzítettük, és az ImageJ (NIH; http://rsb.info.nih.gov) nyilvános szoftverrel számszerűsítettük (Schneider et al., 2012).

Statisztika

A statisztikai elemzéseket GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) alkalmazásával végeztük, egy vagy két farkú t-teszt alkalmazásával, adott esetben.

Köszönetnyilvánítás

Hálásak vagyunk Philip Avnernek (EMBL Monterotondo) B.J részleges pénzügyi támogatásáért; Dr. Jian Guo Chai-nak a Foxp3EGFP egérvonal biztosításáért; a rosenthal-i labor tagjai számára hasznos megbeszélésekre; valamint a Harefield Heart Science Center, a londoni Imperial College és az EMBL Monterotondo állattartó létesítményeinek munkatársainak, akik segítséget nyújtanak az állattenyésztésben és a karbantartásban.

Lábjegyzetek

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő pénzügyi érdekeik.