Az IscR elengedhetetlen a Yersinia pseudotuberculosis III. Típusú váladék és virulencia

Mikrobiológiai és környezeti toxikológiai tanszék, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Jelenlegi cím: Minőségellenőrzési mikrobiológia, Genentech Inc., South San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Mikrobiológiai és környezeti toxikológiai tanszék, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Hovatartozás Biomolecular Engineering, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Biomolekuláris Kémia Tanszék, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Jelenlegi cím: Roche Molecular Systems, Inc. fertőző betegségek osztálya, Pleasanton, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Mikrobiológiai és környezeti toxikológiai tanszék, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Molekuláris, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Jelenlegi cím: Maverix Biomics, Inc., San Mateo, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Hovatartozás Biomolecular Engineering, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Biomolekuláris Kémia Tanszék, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Hovatartozás Biomolecular Engineering, Kaliforniai Egyetem Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Mikrobiológiai és környezeti toxikológiai tanszék, Kaliforniai Egyetem, Santa Cruz, Santa Cruz, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Halie K. Miller,
Laura Kwuan,
Leah Schwiesow,
David L. Bernick,
Erin Mettert,
Hector A. Ramirez,
James M. Ragle,
Patricia P. Chan,
Patricia J. Kiley,
Todd M. Lowe

Ábrák

Absztrakt

Szerző összefoglalása

A baktériumok kórokozói olyan szabályozókat használnak, amelyek érzékelik a környezeti jelzéseket fitneszük javításához. Itt azonosítunk egy transzkripciós szabályozót az emberi bél kórokozójában, a Yersinia pseudotuberculosisban, amely egy speciális szekréciós rendszert irányít, amely elengedhetetlen a baktériumok növekedéséhez az emlős szövetekben. Kimutatták, hogy más baktériumfajoknál ez a szabályozó megváltoztatja aktivitását a vaskoncentráció és az oxidatív stressz változására reagálva, de Yersiniában még soha nem vizsgálták. Fontos, hogy az Y. pseudotuberculosisban a vas biohasznosulása nagy változásokat tapasztal a bélből a mélyebb szövetekbe történő átjutás során, és a vas kritikus eleme a Yersinia virulenciának, mivel a vas túlterhelési rendellenességekkel küzdő egyének fokozott érzékenységet mutatnak a szisztémás Yersinia fertőzések iránt. Munkánk ezt a vasmodulált transzkripciós szabályozót a szabályozó hálózatba helyezi, amely szabályozza a virulencia génexpressziót az Y. pseudotuberculosisban, azonosítva az antimikrobiális szerek potenciális új célpontjaként.

Idézet: Miller HK, Kwuan L, Schwiesow L, Bernick DL, Mettert E, Ramirez HA és mtsai. (2014) IscR nélkülözhetetlen a Yersinia pseudotuberculosis III-as típusú szekréció és virulencia szempontjából. PLoS Pathog 10 (6): e1004194. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004194

Szerkesztő: Partho Ghosh, Kaliforniai Egyetem, San Diego, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. augusztus 5 .; Elfogadott: 2014. május 6 .; Közzétett: 2014. június 12

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt az Országos Egészségügyi Intézetek (www.NIH.gov) az AI099747 (a VA-nak), a GM045844 (a PJK-nak) és a Hellman Fellows Program (www.hellmanfellows.org) (a VA) támogatásával támogatták. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A III. Típusú szekréciós rendszerek (T3SS) fontos elemei a betegség előrehaladásának számos klinikailag releváns emberi kórokozó esetében, beleértve a Shigella, Salmonella, Escherichia, Chlamydia, Vibrio, Pseudomonas és Yersinia nemzetségeket [1], [2] . A T3SS injekcióként működik, amely a baktérium effektor fehérjéket közvetlenül a gazdasejt citoplazmájába juttatja [2]. Míg maga a T3SS készülék strukturálisan konzervált, az egyes kórokozócsoportok által használt T3SS effektor fehérjék repertoárja különbözik [2]. Így a T3SS hatása a gazdaszervezetre egyedülálló a kórokozó igényeire [2]. Míg a T3SS általában nélkülözhetetlen ahhoz, hogy egy T3SS-t expresszáló kórokozó betegséget okozzon, a T3SS számos aspektusa káros lehet a baktériumok szaporodására [2]. Például a T3SS komponenseket a gazdaszervezet immunrendszere ismeri fel [3], [4]. Ezenkívül a T3SS expressziója energetikailag költséges, és egyes organizmusokban a T3SS indukció korrelál a növekedés leállításával [5]. Ezért a szabályozás elengedhetetlen a T3SS megfelelő működéséhez annak biztosítása érdekében, hogy ez csak a gazdasejt érintkezése során következzen be a megfelelő gazdaszövetben [2], [6].

Ebben a tanulmányban két független IscR transzpozon inszerciós mutánt izoláltunk egy új szkrínben a T3SS funkció szempontjából fontos Y. pszeudotuberculosis génekre. Értékeltük az iscR deléció hatását az Y. pseudotuberculosisra in vitro és in vivo növekedésre, a III. Típusú szekrécióra és a globális génexpresszióra. Megállapítottuk, hogy az IscR elengedhetetlen a teljes T3SS funkcióhoz és a virulenciához egy egér fertőzésmodellben. Ezenkívül bizonyítékot szolgáltatunk arra, hogy a T3SS IscR vezérlése az LcrF T3SS főszabályozó közvetlen transzkripciós szabályozásából ered.

Eredmények

IscR szükséges az Y. pseudotuberculosis Ysc T3SS működéséhez

(A) Az Y. pseudotuberculosis DNS szekvencia, amely a genetikai szűrőnkből generált két transzpozon mutáns egyedi inszerciós helyeit jeleníti meg. A DNS-szekvencia helye és egy folytonos fekete vonal jelzi az iscR: Tn1 vagy az iscR: Tn2 beillesztésének helyét. (B) Többszörös szekvenciaillesztést hajtottunk végre az E. coli K12-MG1655-ből származó IscR fehérje szekvencián és mindhárom humán patogén Yersinia spp., Y. pseudotuberculosis IP 32953 (Y. pstb), Y. enterocolitica 8081 (Y. ent) és Y. pestis CO92 (Y. pestis) ClustalW alkalmazásával [86]. Az N-terminális helix-turn-helix DNS-kötő motívumot fekete doboz jelzi. A Fe-S klaszter koordinálásáért felelős három konzervált cisztein-maradék (C92, C98 és C104) félkövéren és fekete nyilakkal van jelölve [33]. A csillagok mind a négy fajban konzerválódott nukleotidokat jelölnek.

Annak igazolására, hogy az IscR elvesztése Y. pseudotuberculosisban T3SS hibákhoz vezet, izoláltuk könyvtárunkból a két iscR transzpozon mutánt (iscR: Tn1 és iscR: Tn2), és ismét megmértük, hogy képesek-e kiváltani az NFκB aktivációt a HEK293T sejtekben a Δyop6 szülői törzs és egy ΔyscNU T3SS-null mutáns [43]. Ezenkívül elkészítettünk egy kereten belüli iscR deléciós mutánst a yyop6 genetikai háttérben (Δyop6/ΔiscR), és teszteltük ebben a vizsgálatban. Megállapítottuk, hogy az iscR megszakadása ∼2-szer kevesebb NFκB-aktivációhoz vezetett a Δyop6 T3SS + szülői törzshez képest, bár az NFκB-aktivációs szintek még mindig ~ 5-ször magasabbak voltak, mint a T3SS-funkció teljes hiányában szenvedő törzsek (ΔyscNU; 2A. Ábra), ami arra utal, hogy az iscR elvesztése részleges T3SS veszteséghez vezet.

Annak igazolására, hogy az iscR törlése a T3SS funkció megváltozásához vezet-e, megvizsgáltuk a Δyop6/ΔiscR mutáns képességét, hogy YopBD pórusokat illesszen be a cél gazdasejt membránjaiba, mérve az etidium-bromid (EtBr) bejutását az Y. pseudotuberculosis által fertőzött csontvelőbe. származtatott makrofágok [45], [46]. Az Δyop6/ΔiscR mutáns által kialakult pórusképződés 7-szeresére csökkent (az Y. pseudotuberculosis vad típusú vagy izogén ΔiscR mutáns törzsek p8 CFU-ja. Az inokuláció után 5 nappal az ΔiscR mutánssal fertőzött egereknél jelentősen csökkent a kolonizáció. A Peyer-foltok és a mesenterialis nyirokcsomók (MLN), valamint a szisztémás kolonizáció csökkenése (3. ábra). Pontosabban a Peyer-foltokból és MLN-ekből kinyert CFU 10-szeres és 130-szoros csökkenését figyeltük meg ΔiscR mutánssal fertőzött egerekben törzs a vad típushoz képest. Különösen a lépben és a májban a baktériumok terhelésének 1000–10 000-szeres csökkenését figyeltük meg. Az ΔiscR mutáns törzs csökkent képességét a mély szöveti helyek kolonizálására alátámasztja az a tény, hogy a baktériumok Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy az IscR elengedhetetlen az Y. pseudotuberculosis virulencia szempontjából egy orális fertőzési modellben.

Az egereket 2x108 CFU-val fertőztük meg vagy WT Y. pseudotuberculosisban, vagy AiscR mutánsban orogasztrikus szondán keresztül. Az oltást követő 5. napon a Peyer-foltokat (PP), a mesenterialis nyirokcsomókat (MLN), a lépeket és a májat összegyűjtöttük, homogenizáltuk és meghatároztuk a CFU-t. Minden szimbólum egy állatot képvisel. A kitöltetlen szimbólumok azt jelzik, hogy a CFU a kimutatási határ alatt volt. A bemutatott adatok három független kísérletből származnak. * p 4. ábra. Az IscR hatással van a globális génexpresszióra az Y. pseudotuberculosisban, vaskos körülmények között.

Az RNAseq elemzést WT és ΔiscR Y. pseudotuberculosison végeztük 3 órán át 37 ° C-on M9-ben történő növekedés után (T3SS-indukáló körülmények), ekkor az összes RNS-t összegyűjtöttük és feldolgoztuk. A kapott könyvtárakat HiSeq2500 Illumina szekvenáló platform segítségével szekvenáltuk 50 bp egyszeri olvasáshoz, és elemeztük a CLC Genomics Workbench alkalmazáson (CLC bio) keresztül. 225 gén RPKM expressziós szintje ≥2-szeres változást mutatott, és három független kísérletből származó korrigált FDR post hoc teszttel végzett Bayseq-teszt alapján szignifikánsnak ítélték őket (p ≤ 0,05). Az alábbiakban bemutatjuk a (A) 133 gén, amelyek az ΔiscR mutánsban a vad típushoz képestB) 92 amelyek lefelé szabályozottak.

A WT és ΔiscR Y. kvantitatív, valós idejű PCR-analízist hajtottuk végre (A) a Fe-S klaszter biogenezis génjein, az iscS és az erpA, valamint (B) a T3SS gének, yscF, yscN és lcrF esetében. A kísérleteket M9-ben 37 ° C-on 3 órán át tenyésztett tenyészetekből végeztük. Megjelennek a három független kísérlet átlagai ± SEM. * p 1. táblázat: IscR által elnyomott gének, RNAseq analízissel azonosítva.

IscR szükséges a T3SS gének transzkripciójához

Összesen 92 gént szabályoztak szignifikánsan alacsonyabban az ΔiscR mutánsban a vad típusú Y pszeudotuberculosishoz képest (2. táblázat). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a pYV-kódolt gének többsége csökken az ΔiscR mutánsban a vad típusú törzshez viszonyítva, beleértve a megfelelő T3SS expresszióhoz és működéshez elengedhetetlen géneket is. A virC és lcrGVH-yopBD operonok, valamint a T3SS rakomány YopHEMOJTK-t kódoló gének voltak a leginkább érintettek az iscR törlésekor: a effektor fehérjék: YopJ (−3,4-szeres), YopM (−5,3-szoros) és YopT (−5,5-szeres) ), az effektor fehérje és a transzlokáció szabályozó YopK (-9,3-szorosa), valamint számos T3SS szerkezeti fehérjét kódoló gén. A T3SS expresszióját és működését szabályozó szabályozókat kódoló gének csökkentek a mutánsban, beleértve az lcrQ-t (-2,1-szeres), az lcrF-t (-3,3-szoros), az lcrG-t (-2,2-szereset) és az lcrH-t (-3,9-szereset). Annak igazolására, hogy a T3SS génexpresszió valóban csökkent-e az ΔiscR mutánsban, qRT-PCR-en keresztül mértük az YscN, YscF és a T3SS transzkripciós regulátor LscF kódoló gének transzkripciós szintjét. Amint azt az 5B. Ábra részletezi, 2,8-szoros csökkenést figyeltünk meg (p 6. ábra. Az apo-IscR mutáns törzs csökkent mozgékonyságot és az elektromos potenciál megzavarását mutatja.

Az IscR felismer egy 2-es típusú motívumot az yscW-lcrF operon előtt

Annak érdekében, hogy megértsük a T3SS hiba természetét csak apo-IscR jelenlétében, RNAseq elemzést végeztünk az Y. pseudotuberculosis apo-lockolt IscR mutánson, amelyet T3SS indukáló körülmények között növesztettünk, és összehasonlítottuk az eredményeket a vad típusú adatokkal és ΔiscR törzsek. Érdekes módon az apo-lockolt IscR mutáns a stresszválaszban, a transzportban, a sejtburokban, valamint az elektrontranszportban részt vevő gének aberráns expresszióját mutatta (az adatokat nem mutatjuk be). Megjegyzendő, hogy az iscRSUA-hscBA-fdx-iscX-pepB-sseB, yadR/erpA és nfuA operonokban kódolt Fe-S klaszter bioszintézis fehérjék jelentősen megnőttek, hasonlóan az ΔiscR mutáns törzséhez (S2A ábra) jelzi, hogy a holo-IscR elnyomja ezen gének expresszióját az alkalmazott aerob, vas-telített körülmények között. Ezzel szemben az apo-reteszelt IscR törzsnél a sufABCDS Fe-S klaszter biogenezis operonjának növekedését figyelték meg, összehasonlítva mind a vad, mind az ΔiscR törzsekkel (S4. Ábra). Mivel az IscR-t 30-szorosan túlexpresszáljuk (p 7. ábra. A funkcionális IscR-kijelző nélküli Y pszeudotuberculosis csökkent számos pYV-kódolt gén transzkripcióját.

Középső és belső gyűrűk: hőtérkép [83] a log2-arányok (log2 (RPKMmutant/RPKMwt)) ábrázolása a pYV plazmid minden egyes génjére mind az ΔiscR (középső gyűrű), mind az apo-IscR (belső gyűrű) mutánsok esetében a vad típushoz viszonyítva. Külső gyűrű: pYV bázis koordinátapozíció Y. pseudotuberculosis IP32953-tól. Ismert géneket azonosítanak, a virA, virB és virC operonokat fekete ívekkel emelik ki. A belső jobb oldalon a színsáv jelmagyarázata jeleníti meg a log2-arányokat −3,5 és 2 között. Ezt a skálát használva a narancssárga/vörös színezetek a mutánsban a vad típusú törzshez képest csökkent transzkripciójú géneket, a kék/zöld szín pedig a mutáns géntranszkripciójának növekedését jelenti a vad típushoz viszonyítva.

Vita

Ebben a tanulmányban bemutatjuk a jersiniai i ron s ulfur c luster r egulator, IscR első jellemzését. Kezdetben az Ysc T3SS funkció modulátorainak genetikai szűrésével azonosították, az iscR-hiányos Y. pseudotuberculosisnak drámai hibája volt a T3SS effektorfehérjék szekréciójában és a makrofágok T3SS-en keresztüli célzásában, ugyanakkor normális növekedést mutatott a húsleves-kultúrában és a vad típusú flagelláris mozgékonyságban. A bioinformatikai és a DNS-kötési elemzés az LcrF T3SS mester szabályozót kódoló operontól egy IscR kötőhelyet mutatott fel, jelezve, hogy az IscR vezérli az Ysc T3SS expresszióját. Ezek a megállapítások együttesen azt jelezték, hogy az IscR az Y. pseudotuberculosis T3SS szabályozó kaszkádjának központi eleme.

Nem világos, hogy az IscR apo-lock formában történő lezárása miért vezet proton mozgási erő hibájához. Az apo-reteszelt IscR mutánsban ~ 9-szer több suf transzkriptumot figyeltünk meg az ΔiscR törzshöz képest, amely nem rendelkezik protonmotoros erőhibával, míg az isc operon mindkét mutánsban azonos mértékben expresszálódott. Ezraty és mtsai. a közelmúltban kimutatta, hogy az suf, de nem az isc operon expressziója az E. coliban proton mozgatóerő hibához vezet, valószínűleg a Fe-S klaszterek aerob légzési komplexekbe történő terhelésének romlása következtében [55]. Jóllehet az isc operon az apo-zárolt Y. pseudotuberculosis mutánsban fejeződik ki, a suf út túlzott expressziója talán az elektrontranszportlánc Fe-S komplexeinek rossz összeillesztéséhez vezet, amelyek hajtják a proton motorját.

Összefoglalva bemutatjuk a jersiniai i ron s ulfur c luster r egulator, IscR első jellemzését. Kimutattuk, hogy az IscR az E. coli-hoz hasonló módon szabályozza a Fe-S klaszter összeállításában részt vevő géneket. Legfőképpen azt mutatjuk be, hogy az IscR mutációja az Y. pseudotuberculosis T3SS funkciójának csökkenéséhez vezet, és ez annak köszönhető, hogy csökken a strukturális, szabályozó és effektor fehérjéket kódoló gének transzkripciója. Továbbá bemutatjuk azokat a bizonyítékokat, amelyek azt mutatják, hogy az IscR elengedhetetlen az Y. pseudotuberculosis virulenciájához, és hogy ez a gyengülés valószínűleg annak tudható be, hogy a T3SS-t közvetlenül IscR szabályozza. Ez a tanulmány együttesen érvel az IscR fontos és új szerepével az Y. pseudotuberculosis virulenciájában, valamint az Ysc T3SS szabályozásában, és meghatározza az IscR-t az új antimikrobiális szerek potenciális célpontjaként.

Anyagok és metódusok

Minden állathasználati eljárás szigorúan összhangban volt a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó NIH útmutatóval, amelyet az UCSC Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyott jóvá.

Baktériumtörzsek, plazmidok és növekedési körülmények

Az ebben a vizsgálatban használt összes törzset a 3. táblázat tartalmazza. Az Y. pseudotuberculosis törzseket 2xYT vagy M9 minimális táptalajban tenyésztettük, aminosavakkal kiegészítve [68], amelyeket itt M9-nek nevezünk, 26 ° C-on, 250 fordulat/perc rázással, hacsak másként jelezték. Ahol meg van adva, a Yop-szintézist a tenyészetek M9-es vagy alacsony kalcium-táptalajba történő visszahígításával indukálták (2xYT plusz 20 mM nátrium-oxalát és 20 mM MgCl2) 0,2-es OD600-ig, majd 1,5 órán át 26 ° C-on/rázással növeltük. 2 óra 37 ° C-on/rázás a korábban leírtak szerint [69].