Az L box regulon: A lizin érzékelése a bakteriális lizin bioszintézis gének vezető RNS-ével

Szerkesztette Susan Gottesman, National Institute of Health, Bethesda, MD, és jóváhagyta 2003. augusztus 20-án (2003. június 16-án kapott felülvizsgálatra)

Absztrakt

L box lizin bioszintézis gének. (A) Lizin bioszintézis útja a B. subtilis-ban. Azokat a géneket, amelyekről kiderül, hogy bármely szervezetben tartalmaznak L box vezetőket, megcímkézzük (lásd a 2. táblázatot, amelyet alátámasztó információként a PNAS weboldalán (www.pnas.org) teszünk közzé), és a megfelelő enzimtermék zárójelben látható. Három aszpartokinázt kódoló gént azonosítottak a B. subtilis-ban; Az lysC az aszpartokináz II-t, az enzim lizinre reagáló formáját kódolja. A vegyületek alternatív szerepét ezen az úton szaggatott nyilakkal mutatjuk be. (B) A lizin és rokon vegyületeinek szerkezete.

Ebben a tanulmányban a lizin bioszintézis génjeinek filogenetikai elemzésével egy komplex vezető RNS szerkezeti tömböt tárunk fel, amely konzerválódott számos organizmusban, beleértve az alacsony G + C Gram-pozitív baktériumok és a γ-proteobaktériumok tagjait is. Ezek az RNS-ek nagyon hasonló másodlagos szerkezeti jellemzőkkel rendelkeznek, annak ellenére, hogy a primer szekvencia nagyon kevéssé konzervált. Feltételezett transzkripciós terminátorokat és versengő antiterminátorokat találtak a Gram-pozitív organizmusok lizin génjeiben, és a B. subtilis lysC gén terminációját mutatták ki a lizinre adott közvetlen válaszként. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy a gram-negatív organizmusok génjei a transzláció iniciációjának szintjén vannak szabályozva.

Anyagok és metódusok

A B. subtilis lysC vezető strukturális modellje. A számozás az átírás kezdőpontjához (10) viszonyul. Az 1–5. Hélixeket dobozos számokkal látják el. T, terminátor; AT, antiterminátor; AAT, antiterminátor. Az antiterminátort úgy alakítják ki, hogy a 191–217. Pozícióból származó maradékokat összekapcsolják a 223–255. A vörös maradványok a szekvenciák 100% -ában, a kék maradványok pedig a szekvenciák> 80% -ában találhatók (5. ábra); zöld maradványok és szaggatott vonalak mutatják a lehetséges harmadlagos kölcsönhatást a 2. és 3. hélix hurkai között. Az üreges kisbetűk olyan mutációkat jeleznek, amelyek korábban bizonyítottan ellenállást okoznak az AEC és/vagy a konstitutív lysC expresszióval szemben (9. és 10. hivatkozás és H. Paulus, személyes kommunikáció ). Az ebben a vizsgálatban felépített mutációkat (Xba-1, Xba-2, Xba-3) szilárd kisbetűkkel jelölik. A mutánsok szekvencia-változásai: Xba-1, A31U/A32C/G33U/U35G; Xba-2, G108U/C110U/G111A/A112G; Xba-3, A198C/C200A/U201G/C202A. A feltételezett S-turn és GA motívum elemeket felcímkézik.

In vitro transzkripciós vizsgálatok. Az in vitro transzkripció sablonjait PCR-rel állítottuk elő olyan oligonukleotid primerek alkalmazásával, amelyek a B. subtilis glyQS promoter régiót (12) tartalmazták és a B. subtilis lysC gén vezető régiójában hibridizáltak. A kapott PCR-termék tartalmazta a glyQS promótert, amely fuzionált volt a lysC vezető régióhoz, így a transzkripció 1 n-t indított el a lysC transzkriptum C17-elől (10). Ezt a helyet úgy választottuk meg, hogy lehetővé tegye az ApC dinukleotiddal történő iniciálást és a G42 pozícióban történő megállást (2. ábra) CTP hiányában történő iniciálással. A PCR-fragmens promóter-disztális vége 95 bázispárral volt a vezető régió terminációs helyétől lefelé, hogy lehetővé tegye a terminált és átolvasott termékek (253, illetve 348 nt) felbontását. A PCR termékeket Qiagen PCR tisztító készlettel (Qiagen, Chatsworth, CA) tisztítottuk. A vezető régió mutánsainak sablonjait PCR-rel állítottuk elő a megfelelő alléleket tartalmazó templát DNS-ekkel. Az ykrW sablont leírták (15).

Az egyfordulós transzkripciós reakciókat a leírtak szerint hajtjuk végre (12) templát DNS-sel (10 nM) és His-tagjelölt B. subtilis RNS polimerázzal (RNAP) (6 nM) tisztítottuk Qi és Hulett (25) leírása szerint. Az iniciációs reakciók 1x transzkripciós puffert (26), ApC-t (150 μM; Sigma), GTP-t (2,5 μM), ATP-t (2,5 μM), UTP-t (0,75 μM) és [α-32 P] UTP-t (0,25 μM) tartalmaznak., 800 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq), inkubáltuk 37 ° C-on 15 percig. Heparint (20 μg/ml; Sigma) adtunk az újrakezdés blokkolásához, és a megnyúlást NTP-k hozzáadása váltotta ki más reagensek 10 μMint jelenlétében a jelzett módon. A megnyúlási reakciókat további 15 percig 37 ° C-on inkubáltuk, és fenollal végzett extrakcióval állítottuk le. A transzkripciós termékeket a PAGE denaturálásával oldottuk meg, és PhosphorImager (Molecular Dynamics) elemzéssel tettük láthatóvá.

Eredmények

Az L Box motívum szerkezeti elrendezése. Az L doboz vezető régió mintája öt spirális doménből (1–5. Hélix) áll a vezető régió belső terminátora előtt (2. ábra); a gram-negatív organizmusok génjeiben (amelyek mindegyike lysC), a terminátor spirál helyét spirálszerkezet váltja fel, amely magában foglalja a lysC Shine-Dalgarno szekvenciát, ami azt sugallja, hogy funkciója blokkolja a riboszóma hozzáférését az mRNS-hez. Mindegyik vezetőben kialakítható egy alternatív struktúra, amely párosítja az 1 hélix 3 'oldalán lévő szekvenciákat a terminátor (vagy a transzlációs represszor hélix) 5' oldalán lévő szekvenciákkal, így a két szerkezet egymást kizárja. Ez az alternatív elem javasolt antiterminatorként (Gram-pozitív organizmusok génjeihez) vagy transzláció antirepresszoraként (Gram-negatív organizmusok génjeihez).

Az L doboz öt spirális doménje egy központi magból sugárzik (2. ábra). Az 1. és 2. hélix közötti csatlakozási régió konzervált AGG-szekvenciát tartalmaz, közvetlenül az 1. spirál szomszédságában. A Helix 2 két következetesen elhelyezett belső hurkot tartalmaz. A központi magrészhez közeli hurok konzervált 5'-AGUA-3 'és 5'-GAAA-3' elemeket tartalmaz az ellentétes oldalakon, az S-turn (vagy E hurok) RNS szerkezeti motívumával összhangban lévő elrendezést, amely forduljon a spirál gerincéhez (27). A spirál 2 disztális belső hurkja aszimmetrikus, ellentétes GA csoportokkal; ez az elrendezés megegyezik a T-box és az S-box vezető RNS-ében talált GA motívummal (28), és megfelel annak a kink-turn motívumnak, amely törést képez az RNS gerincében (29). A GA motívum hiányzik a Staphylococcus L box génekből, míg az S-turn motívum kevésbé hangsúlyos a gram-negatív eredetű vezetőkben; mindazonáltal az összes helix 2 tartomány két belső hurkot tartalmaz, amelyek közül legalább az egyik illeszkedik az S-turn vagy a GA motívum mintájához.

A 3. és 4. hélix egyszerű elemnek tűnik, amely általában gyenge párokat tartalmaz (G: U vagy U: G ingadozó párok, nyírt G: A párok vagy nem megfelelőek). A 4 spirál hurkja jelentős primer szekvencia konzervációt mutat, és a 3. és 4. spirált nagyon erősen konzervált maradékok szegélyezik (2. ábra). A Helix 5 viszonylag rövid a Gram-pozitív eredetű génekben, és kiterjedt a Gram-negatív eredetű génekben; a Klebsiella pneumoniae lysC vezetője két extra spirális elemet tartalmaz az 5 spirálon belül. Az 5 és 1 spirálok találkozási helye konzervált GAG maradványokat tartalmaz, általában közvetlenül 3'-től az spirálig 5. elsődleges szekvencia szint, ami arra utal, hogy a magrész szerkezeti elrendezése szorosan korlátozott.

Az L box motívum lehetséges tercier struktúrájának további bepillantása érdekében megvizsgáltuk az összes párosítatlan régió komplementaritását. A 2. és 3. hélix hurkai komplementer maradékokat mutatnak, általában 5 nm-rel képesek párosodni; a két hurokszekvencia kiterjedt kovariációt mutat. A helix 2 belső hurkai és a helix 3 gyenge párjai hozzájárulhatnak e hurokrégiók kölcsönhatásához. A magrégióban lévő konzervált maradványok az 1–5. Hélix találkozásánál további párosításokat hozhatnak létre, de a nagyon magas tartósság megakadályozza a kovariációval történő megerősítést.

A lysC Leader régió mutációinak hatása. Az egyes vezető RNS-ekben a terminátor (vagy transzlációs represszor) spirál (a spirál hossza és a GC párok száma alapján) kevésbé stabil lesz, mint a versengő antiterminátor (vagy antirepresszor) spirál, amely szekvenciák párosításával jön létre az 5 ' a terminátor oldala az 1-es spirál 3'-oldalán lévő szekvenciákkal, amelyek gyakran tartalmaznak szekvenciákat az 5-es spirál és az 1-es spirál között és ezért elősegíti a megszűnést, amikor a lizin bőséges.

A lizin elősegíti a transzkripció megszűnését a B. subtilis RNAP általi in vitro transzkripció során. A B. subtilis glyQS promótert tartalmazó B. templátokat a B. subtilis lysC vezető C17 pozíciójához fuzionálva hoztuk létre, hogy lehetővé tegyük a vezető szekvencia szabályozó tulajdonságainak vizsgálatát a lysC promótertől függetlenül. A vezető régió terminátorának átolvasása hatékony volt lizin hiányában, és a terminációt 3 mM l-lizin hozzáadásával stimuláltuk (3A. Ábra, 1. és 2. sáv). A lizinre adott válasz specifikus volt, mivel a DAP-nak és a SAM-nak nem volt hatása (3A. Ábra, 3. és 5. sáv); Az AEC gyengébb terminációs aktivitást mutatott (3A. Ábra, 4. sáv), és az AEC-koncentráció 10-szeresére volt szükség ahhoz, hogy a válasz a lizinnel megfigyelthez hasonló legyen (az adatokat nem mutatjuk be). A lizinnek nem volt hatása az ykrW S dobozvezető (3A. Ábra, 7. sáv) befejezésére, amely ehelyett reagál a SAM-ra (3A. Ábra, 8. sáv és 15. hivatkozás). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a lizin specifikusan elősegíti a lysC vezető terminációját, és általában nem okozza a transzkripció terminációt a B. subtilis RNAP által. Hasonló eredményeket kaptunk az E. coli RNAP alkalmazásával (az adatokat nem közöltük), jelezve, hogy a hatás független az RNAP forrásától.

A B. subtilis lysC in vitro transzkripciója. A nyilak az átolvasható (RT) és a befejezett (T) átiratok pozícióit mutatják. A sávszélesség (% T) az egyes sávok alján látható. A DNS templátokat (lysC vagy ykrW) B. subtilis RNAP-val írtuk át. (A) Lizin-függő transzkripciós termináció. Lizint (lys), DAP-t, AEC-t és SAM-ot adunk hozzá 3 mM koncentrációban. (B) A mutáns lysC templátok in vitro transzkripciója. 3 mM (+) koncentrációban lizint adunk hozzá. WT, WT lysC; Xba-1, Xba-1 mutáció; Xba-2, Xba-2 mutáció; Xba-3, Xba-3 mutáció; Xba-1/3, Xba-1 és Xba-3 kettős mutáns. A mutációkat a 2. ábra mutatja.

A vezető mutációk in vitro lizin-irányított terminációra gyakorolt hatását is tesztelték (3B. Ábra). Az Xba-1 és Xba-2 mutációk a termináció elvesztését eredményezték, összhangban az in vivo eredményekkel. Az Xba-3 mutáció, amely a hélix 1 3'-oldalán lévő maradékokat befolyásolja (2. ábra), a lizin jelenlététől függetlenül fokozta a terminációt, jelezve, hogy a helix 1 megszakadása blokkolja a lizinre adott választ; ennek a mutációnak az elmulasztása az átolvasás teljes elvesztésének következménye összhangban áll az in vivo eredményekkel, és oka lehet az a tény, hogy ez az allél nem bontja meg teljesen az antiterminátor elemet. Az Xba-1 és Xba-3 allélek kombinációja az előrejelzések szerint helyreállítja a helix 1 párosodását, a hélix stabilitásának növekedésével. A kettős mutáns fokozott terminációt mutatott az Xba-3 mutánshoz képest, összhangban azzal a jóslattal, hogy a helix 1 képződése elősegíti a terminációt. A lizinre adott válasz hiányát az antiterminátor lizintől független stabilizálása és az antiterminátor destabilizálása és/vagy a szekvenciaváltozások lizinkötésre gyakorolt hatása okozhatja. Összességében ezek az eredmények alátámasztják a modellt és azt a hipotézist, hogy az átolvasás a rendszer alapértelmezett állapota.

Lizintől függő strukturális átmenet a lysC RNS-ben. (A) A B. subtilis lysC vezető strukturális modellje az átolvasás (-lyzin) és a termináció (+ lizin) konformációkban. Az antiszensz oligonukleotidok a és b párosításának helyzete, az Xba-1 és Xba-2 mutációk helyzete (2. ábra) és a transzkripciós termékek végpontjai láthatók. (B) Antiszensz oligonukleotid, a +17 és +228 közötti lysC szekvenciákat tartalmazó átiratok RNáz H-os hasítása (211-nt transzkriptum, amely az antiterminátor 5'-oldalát tartalmazza, de nem a 3'-oldalt). A transzkripció lizin (3 mM) jelenlétében (+) vagy hiányában (-) volt. A nyilak az RNáz H hasítási termékeket jelzik, amelyeket csak az oligonukleotid hozzáadása után figyeltünk meg. (C) Antiszensz oligonukleotid b irányított RNáz H hasítása a transzkriptumokról, amelyek + 17 és +253 közötti lysC szekvenciákat tartalmaznak (236 nt transzkriptum, amely tartalmazza a teljes antiterminátort, de hiányzik a terminátor 3 'oldala). A nyilak az RNáz H hasítási termékeket jelzik, amelyeket csak az oligonukleotid hozzáadásakor figyeltünk meg.

Vita

A DAP-val ellentétben az AEC nem normális sejtkomponens. Az AEC abban különbözik a lizintől, hogy egyetlen szénatomot kénnel helyettesítenek (1B. Ábra). A B. subtilisban és az E. coliban az AEC-vel szembeni rezisztencia a lysC expresszió derepressziójából származhat; az L box minta azonosítása magyarázatot ad a korábban jellemzett AEC R mutációk hatására (8–10. és H. Paulus, személyes kommunikáció). A mutánsokban megfigyelt aszpartokináz II aktivitás növekedése nyilvánvalóan elegendő a magasabb lizinkészletek felhalmozódásához, amelyek csökkentik az AEC helytelen beépülését. Alternatív lehetőség, hogy az AEC a lizin utánzataként működik, elnyomva az L box gén expresszióját, így az AEC által elnyomott elvesztéssel az ellenállás következik be. Az in vitro hatékony lysC transzkripciós terminációra vonatkozó követelmény, hogy a lizinhez képest tízszer nagyobb AEC-koncentrációra van szükség, arra utal, hogy az AEC valószínűleg nem okoz lysC-elnyomást in vivo.

Figyelemre méltó, hogy minden szabályozó rendszerben, amely vezető RNS-eket használ egy effektor molekula közvetlen nyomon követésére, nagyon magas a specifitás a rokon effektorra. Például a T box vezető RNS-ek szelektíven csak a rokon tRNS-t ismerik fel, és további különbséget tesznek a töltés nélküli és töltött tRNS között. Az S box RNS-ek reagálnak a SAM-ra, de nem az S-adenozil-homociszteinre. Az L box RNS-ek specifikusak a lizinre, és nem a DAP-ra. Ez a specifitás az ezen érzékszervi RNS-ek biológiai funkciójának velejárója a fiziológiai jelek monitorozásában a sejt komplex környezetében. Nagyon érdekes lesz összehasonlítani az egyes RNS-csoportok azon tulajdonságait, amelyek szükségesek a rokon effektor felismeréséhez és a rokon molekulák megkülönböztetéséhez.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük H. Paulusnak, hogy publikálatlan adatokat szolgáltatott az AEC R mutációkról és a lysC expresszióról, és F. M. Hulettnek a törzs biztosításáért a B. subtilis RNAP előállításához. Ezt a munkát a National Health Institutes of Health Grant GM63615 támogatta.