Határok az immunológiában

Molekuláris veleszületett immunitás

Szerkesztette
Liwu Li

Virginia Tech, Egyesült Államok

Felülvizsgálta
Min Wu

Észak-Dakotai Egyetem, Egyesült Államok

Joan Clària

Clínic de Barcelona kórház, Spanyolország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

részt

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • Gyulladás- és immunitás osztály, Észak-Ohio Alkoholközpont, Májbetegségkutató Központ, Clevelandi Klinika, Lerner Kutatóintézet, Cleveland, OH, Egyesült Államok

Bevezetés

Az alkohol okozta májbetegség (ALD) a máj okozta rendellenességek legfőbb oka, és világszerte hozzájárul az alkohol okozta halálozások 25% -ához (1, 2). Az ALD-t progresszív máj steatosis, fibrózis és cirrhosis jellemzi; az alkoholos hepatitis (AH), akut gyulladásos állapot, a betegség spektrumának bármely pontján előfordulhat, és súlyos AH esetén magas a rövid távú halálozás aránya (3). Míg az AH okai nem ismertek, az alkoholfogyasztás növeli a bél áteresztőképességét, ami mind a mikrobák, mind a mikrobiális termékek, köztük a lipopoliszacharid (LPS), a β-glükán és más kórokozóhoz kapcsolódó molekuláris minták (PAMP) transzlokációjához vezet a portál keringésében, aktiválva veleszületett immunválasz a májban (4, 5).

Az első immunsejtek, amelyek ezekre a PAMP-kre reagálnak, a Kupffer-sejtek, a májban található rezidens makrofágok (6, 7). A krónikus etanol-expozíció érzékenyíti a Kupffer-sejteket a PAMP-k általi aktiválódásra, ami súlyosbítja a gyulladásgátló reakciókat (6–8). A makrofágok pro- és gyulladáscsökkentő reakcióit polarizációs állapotuk befolyásolhatja (9). A makrofág polarizáció az aktivációs állapotok spektruma, bár kevéssé ismert, hogy ezek a különböző fenotípusok hogyan működnek in vivo és egyéni sejtszinten. In vitro A polarizáció tanulmányai a specifikus aktiváló jelek, például az LPS/IFNγ által kiváltott M1 (pro-gyulladásos) polarizáció és az specifikus M2 (gyulladáscsökkentő) polarizált makrofágok IL-10 vagy IL-4 indukciója által generált fenotípusokra összpontosítanak. . A polarizációt jellemzően a különböző pro- és gyulladáscsökkentő hatásokat kiváltó sejtfelszíni markerek, köztük a CD86 (M1) és a CD206 (M2) expressziója jellemzi (10, 11).

A miRNS-ek kicsi, nem kódoló RNS-ek, amelyek az mRNS-hez kötődve és a transzláció gátlásával szabályozzák a génexpressziót. 2 mechanizmuson keresztül írják át pri-miRNS-ként: (1) magányos transzkripciós egységekként vagy (2) együtt írják át és dolgozzák fel a gazda mRNS-ek intronjából. A pri-miRNS-eket ezután két érett miRNS-vé dolgozzák fel, −5p és −3p (18, 19). Az M1 és M2 polarizált makrofágok, valamint a nem polarizált monociták kicsi RNS-szekvenálása és mikro-sugarai kimutatták a polarizáció dinamikus szabályozását tucatnyi miRNS-sel (20). Nemrégiben csoportunk és mások munkája során azt találták, hogy a miRNS-ek fontos szabályozó szerepet játszanak az etanolra reagálva (17, 21–24). A miR-181b-3p-t krónikus etanollal táplált patkányokból izolált Kupffer-sejtekben szabályozták, ami az α5 importin és az NFκB szignalizációjának felfelé történő szabályozásához vezet. Az miR-155 etanolt tartalmazó táplálékkal etetett egerekből izolált Kupffer-sejtekben expresszálódik, és a miR-155 elvesztése gyengíti az LPS-re adott választ (23-25). A miR-27a-t az emberek akut alkoholfogyasztása indukálja, és a makrofágokat az M2 polarizációja felé tolja el (17).

Anyagok és metódusok

Az etanollal táplált patkányoktól elkülönített Kupffer-sejtek kis RNS-szekvenálása

Alkoholos hepatitis és egészséges kontroll beteg kiválasztása

A beiratkozott betegeknél az Clevelandi Klinika és a Clevelandi Egyetemi Kórházak klinikusai megerősítették az alkoholos hepatitis diagnózisát, kórtörténet, fizikális vizsgálat és laboratóriumi eredmények alapján, az American College of Gastroenterology irányelveinek megfelelően [https: // gi. org/klinikai-irányelvek /]. Egészséges kontroll alanyokat toboroztak a Clevelandi Klinika klinikai kutatási egységéből. A vizsgálati protokollt a Clevelandi Klinika és a Clevelandi Egyetemi Kórházak Intézményi Felülvizsgálati Testülete jóváhagyta az emberi alanyok kutatásának védelmében. Valamennyi módszert az IRB irányelveinek és szabályzatának megfelelően hajtottuk végre, és minden alanytól írásos tájékozott beleegyezést kaptunk.

Humán PBMC-k izolálása

A PBMC-k izolálását emberi vérből sűrűséggradiens centrifugálással végeztük Ficoll-Paque PLUS-on. Röviden: 1 ml frissen gyűjtött Buffy Coat-ot 1: 5 (térfogat/térfogat) arányban összekevertünk PBS-sel 37 ° C-on, majd az elegyet felosztottuk és 8 ml Ficoll-Paque PLUS-ra rétegeztük két 15 ml-es kúpos centrifugacsőben. . 400 × g-vel 30 percig 20 ° C-on (fékezés nélkül) végzett centrifugálás után a buffy réteg frakciókat összegyűjtöttük, összegyűjtöttük, és táptalajban újraszuszpendáltuk (RPMI-1640 100 μM penicillin-sztreptomicinnel és 10 térfogat% FBS-szel kiegészítve) és centrifugáltuk. 400 × g 15 percig 20 ° C-on. A pelleteket 8 ml táptalajban szuszpendáltuk, megszámoltuk, majd ismét 400 x g-vel 8 percig 20 ° C-on centrifugáltuk. A sejteket ezután krióperzisztáltuk fagyasztó közegben (50% tenyésztő tápközeg, 40% FBS, 10% DMSO) szuszpendálva 1,5x106 sejt/ml koncentrációban, és hagytuk lassan -80 ° C-ra fagyni hungarocellben. tartály. A hosszú távú megőrzés érdekében a sejteket folyékony nitrogénben tároltuk. A kísérletekhez a sejteket 37 ° C-on felolvasztjuk, majd lassan hozzáadunk 8 ml meleg táptalajhoz. 400 x g-vel 8 percig 20 ° C-on végzett centrifugálás után a sejteket újraszuszpendáltuk és 96 lyukú lemezeken nedvesített atmoszférában (5% CO2, 37 ° C) tenyésztettük. 18 óra elteltével a sejteket táptalajjal mossuk és további 60 percig 10 ng/ml LPS-sel kezeljük.

CD14 + és CD16 + monociták izolálása

A CD14 + és CD16 + monocitákat mélyhűtött és felolvasztott PBMC-kből izoláltuk az EasySep Human Monocyte Enrichment Kit segítségével, CD16-mentesítés nélkül (StemCell Technologies, Cambridge, MA), a gyártó utasításainak betartásával, DNSse-kezeléssel a sejtek összecsomósodásának megakadályozása érdekében. Az izolálás után a sejteket csövekben tenyésztettük és 24 órán keresztül inkubáltuk az RNS extrakciója előtt.

Szekvenciaelemzés, PCA és a differenciál expresszió kiszámítása

A szekvenálási adatokat a patkány genomjához (Rnor_6.0) igazítottuk Bowtie2 segítségével a -nagyon érzékeny-helyi beállítás (27). Az annotált miRNS-ek expresszióját egyedi perl szkriptek segítségével határoztuk meg. A PCA-t R-ben végeztük, TPM (milliónyi transzkriptum) konvertált adatok felhasználásával. A differenciál expressziót az EdgeR alkalmazásával számítottuk, a kezdeti cut-off> 0 leolvasással a minták legalább 1/4-én, végül pedig az FDR 0,915 cut-off és r * szignifikánsan különböztek az egészséges kontrolloktól (o * szignifikánsan különböztek az egészséges kontrolloktól (o + és CD16 + monociták AH-betegekből (n = 5) és egészséges kontrollok (n = 3) qPCR-vel mérve. Az értékek a ± SEM átlagot jelentik, a * szignifikánsan különbözött az egészséges kontrolltól (o * szignifikánsan különböztek az egészséges kontrolloktól (o + és CD8 + T-sejtek (38).

A miRNS-klaszterek koordináltan vannak kifejezve

Mivel a gazda gének szabályozzák a miRNS expresszióját, azt jósoltuk, hogy az ugyanazon gazda génen belül található miRNS-ek erősen korrelálnak az expresszióval. Az AH-ban differenciáltan expresszált miRNS-ek közül ugyanabból a klaszterből származó miRNS-ek hasonlóan viselkedtek; A miR-221-5p és miR-222-5p miRNS-eket (a miRNS 11. klaszteren belül) az AH-ban mind felül szabályozták, míg a miR-214-5p, miR-214-3p és a miR-199a-3p (miRNS klaszter 8) nem. (4A, C ábra).

Megfigyeltük a korrelációt a klaszterezett miRNS-ek között, például a miR-221-5p és a miR-222-5p erősen expresszálódott egészséges kontrollokban és AH-ban szenvedő betegeknél (6A. Ábra). Fontos megjegyzés: a miR-221-5p és miR-222-3p expressziója szintén erősen korrelált a patkány Kupffer sejtjeiben, bár a miR-221-3p és miR-222-3p nem (2B. Ábra).

6. ábra. A miRNS expresszió a klasztereken belül korrelál egészséges egészséges és AH betegeknél. (A, C) A log2 transzformált miRNS expressziós adatok scatterplotja qPCR mérésekből. Fekete – egészséges kontroll, vörös – AH beteg. Az R értékek a Pearson-féle korrelációs együtthatók, (o * jelentős összefüggést mutat (o * fajok és szerepük a mieloid sejtekben. Vér. (2011) 118: 3350–8. doi: 10.1182/blood-2010-10-312454

38. Juzenas S, Venkatesh G, Hubenthal M, Hoeppner MP, Du ZG, Paulsen M és mtsai. Az emberi perifériás vér átfogó, sejtspecifikus mikroRNS katalógusa. Nukleinsavak Res. (2017) 45: 9290–301. doi: 10.1093/nar/gkx706

39. Altuvia Y, Landgraf P, Lithwick G, Elefant N, Pfeffer S, Aravin A és mtsai. Az emberi mikroRNS-ek csoportosulása és konzervációs mintái. Nukleinsavak Res. (2005) 33: 2697–706. doi: 10.1093/nar/gki567

40. Sakai A, Saitow F, Maruyama M, Miyake N, Miyake K, Shimada T és mtsai. A miR-17-92 mikroRNS-klaszter krónikus neuropátiás fájdalomban több funkcionálisan összefüggő, feszültségtől függő káliumcsatornát szabályoz. Nat Commun. (2017) 8: 16079. doi: 10.1038/ncomms16079

41. Hildebrand D, Eberle ME, Wolfle SM, Egler F, Sahin D, Sahr A és mtsai. A Hsa-miR-99b/let-7e/miR-125a klaszter szabályozza a kórokozók felismerését receptor által stimulált szuppresszív antigént bemutató sejteket. Front Immunol. (2018) 9: 1224. doi: 10.3389/fimmu.2018.01224

42. Khuu C, Utheim TP, Sehic A. A fejlődésben és betegségben szenvedő három paralóg mikroRNS-klaszter, miR-17-92, miR-106a-363 ​​és miR-106b-25. Scientifica. (2016) 2016: 1379643. doi: 10.1155/2016/1379643

43. Vigetti D, Deleonibus S, Moretto P, Bowen T, Fischer JW, Grandoch M és mtsai. A hialuronán-szintáz 2 természetes antiszensz transzkripciója (HAS2-AS1) fehérje O-GlcNAcilációval indukálja a HAS2 transzkripcióját. J Biol Chem. (2014) 289: 28816–26. doi: 10.1074/jbc.M114.597401

44. Chan J, Atianand M, Jiang Z, Carpenter S, Aiello D, Elling R és mtsai. Élelő: egy természetes antiszensz transzkriptum, az AS-IL1alpha, szabályozza a proinflammatorikus IL-1alpha citokin indukálható transzkripcióját. J Immunol. (2015) 195: 1359–63. doi: 10.4049/jimmunol.1500264

45. Curtale G, Renzi TA, Mirolo M, Drufuca L, Albanese M, De Luca M és mtsai. A TLR4 útvonal többlépcsős szabályozása a miR-125a segítségével

let-7e klaszter. Front Immunol. (2018) 9: 2037. doi: 10.3389/fimmu.2018.02037

46. ​​Kim SW, Ramasamy K, Bouamar H, Lin AP, Jiang D, Aguiar RC. A miR-125a és miR-125b mikroRNS-ek konstitutív módon aktiválják az NF-kappaB útvonalat azáltal, hogy a tumor nekrózis faktor alfa által indukált 3 fehérjét célozzák (TNFAIP3, A20). Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109: 7865–70. doi: 10.1073/pnas.1200081109

47. Ganan-Gomez I, Wei Y, Yang H, Pierce S, Bueso-Ramos C, Calin G és mtsai. A miR-125a túlzott expressziója myelodysplasticus szindrómában A CD34 + sejtek modulálják az NF-kappaB aktivációt és fokozzák az erythroid differenciálódás leállását. PLOS ONE. (2014) 9: e93404. doi: 10.1371/journal.pone.0093404

48. Eigsti RL, Szudán B, Wilson ME, Graff JW. Az aktivációval összefüggő mikroRNS akkumulációs sebességek szabályozása a monocita-makrofág differenciáció során. J Biol Chem. (2014) 289: 28433–47. doi: 10,1074/jbc.M114.599316

Kulcsszavak: alkoholos hepatitis, alkoholos májbetegség, kupffer sejtek, makrofágok, monociták, perifériás vér mononukleáris sejtek, miRNS expresszió, kicsi RNS szekvenálás

Idézet: Kim A, Saikia P és Nagy LE (2019) az M1/​​M2 hiperpolarizációba bevont miRNS-ek csoportosulnak és koordináltan expresszálódnak az alkoholos hepatitisben. Elülső. Immunol. 10: 1295. doi: 10.3389/fimmu.2019.01295

Beérkezett: 2019. március 01 .; Elfogadva: 2019. május 21 .;
Publikálva: 2019. június 07.

Liwu Li, Virginia Tech, Egyesült Államok

Joan Clària, Clínic de Barcelona Kórház, Spanyolország
Min Wu, Észak-Dakotai Egyetem, Egyesült Államok