Az NBD-koleszterin alkalmazása egy kisebb, de NPC1L1-független koleszterin felszívódási útvonal azonosítására az egér belében

Absztrakt

Az étrendi koleszterin felszívódásának gátlásával a plazma koleszterinszintjének csökkentésére irányuló vizsgálatok az ezetimib kifejlődéséhez vezettek, amely kifejezetten 54% -kal csökkenti a teljes koleszterin felszívódást, és 15% -kal csökkenti a plazma LDL-koleszterin szintjét (26). Az ezetimib gátló mechanizmusának meghatározására tervezett tanulmányok a Niemann-Pick C1-szerű 1-et (NPC1L1) azonosították az ezetimib egyik célpontjaként (8). Az NPC1L1 fontosságát a koleszterin felszívódási útjában és ezetimib általi gátlását olyan kísérletek bizonyították, amelyek azt mutatták, hogy az Npc1l1 -/- egerek csökkentik a koleszterin felszívódását, és hogy a maradék koleszterin felszívódás nem érzékeny az ezetimib gátlására (1). Ezenkívül az NPC1L1 expressziós mintázat emberi variációi nemcsak a koleszterin felszívódás hatékonyságával, hanem az ezetimib terápiára adott változatos válaszukkal is korrelálnak (2, 24).

Ezek a tanulmányok dokumentálták az NPC1L1 jelentőségét a teljes koleszterin felszívódási folyamatban, amely folyamat magában foglalja a koleszterin felvételét a bél lumenéből a nyálkahártyába, a koleszterin észterezését és az enterocitákon belüli chilomikronokká történő összeszerelést, valamint a nyirokba történő szekréciót. Nem világos azonban, hogy az NPC1L1 szükséges-e a koleszterinfelvételhez, amint azt eredetileg javasolták (1), és/vagy szükséges-e az intracelluláris koleszterin transzporthoz az endoplazmatikus retikulumba (ER) a lipoprotein összeállításához, amint azt más vizsgálatok javasolják (3, 21) . Ennek a tanulmánynak a célja az NPC1L1 szerepének tisztázása a koleszterin felszívódási folyamatban, tesztelve azt a hipotézist, hogy az NPC1L1 megkönnyíti a koleszterin felvételét, de nem szükséges az internalizált koleszterin transzportjához az ER-hez a lipoprotein összeállításához.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Anyagok.

A koleszterint a Sigma-tól (St. Louis, MO) vásároltuk. A radioaktív [1,2-3H] koleszterint, [4- 14C] koleszterint és [1,2-3H] koleszterinétert az American Radiolabeled Chemicals-tól (St. Louis, MO) szereztük be. A 22- (N (-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino) -23,24-bisznor-5-kolén-3β-olot (NBD-koleszterin) az Invitrogen Molecular cégtől vásároltuk Szondák (Eugene, OR). Az ezetimibét Zetia tablettaként kaptuk, amelyet a Merck Schering Plough-tól (Whitehouse Station, NJ) vásároltak. Az NCS II szöveti szolubilizátort a GE Healthcare-től (Pittsburgh, PA) vásároltuk.

Állatok és diéták.

Az Npc1l1// - egereket az előzőekben leírtak szerint állítottuk elő az Npc1l1 gén megcélzásával (3), és átvittük a Cincinnati Egyetemre, ahol házon tenyésztették őket. Az állatokat, hacsak másképp nem jelezzük, rendszeres chow-étrenden tartottuk. Azoknál az állatoknál, akik ezetimib terápiára kerültek, a Zetia tablettákat porrá őrölték, majd étellel összekeverték, 10 mg Zetia/100 g dózisban. Az összes egeret 12: 12-órás világos-sötét ciklus alatt tartottuk a Cincinnati Egyetem Állat-egészségügyi Szolgáltatások Laboratóriumának hőmérséklet- és páratartalom-szabályozott helyiségében, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Az ebben a vizsgálatban használt összes eljárást a Cincinnati Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá és engedélyezte. Ezekben a vizsgálatokban csak 10-15 hetes hím állatokat használtak.

Koleszterinfelvétel.

A bélminták vékonyréteg-kromatográfiás elemzése.

Az egerek bélmintáiban [3H] koleszterint tartalmazó lipideket kloroform/metanol (2: 1, térfogat: 2 térfogat) elegyével extraháltuk, majd szilikagéllemezeken szétválasztottuk petroléter/etil-éter/ecetsav (300: 150) elegyével. 1.5) oldószerrendszer. A mintákat a jódgőzzel történő összehasonlító referencia-standardokkal együtt tettük láthatóvá. A koleszteril-észter (CE) és a szabad koleszterin (FC) sávokat lekaparták és megszámolták. A CE-vel észterezett koleszterin százalékos arányát a következő egyenlet segítségével határoztuk meg: [CE-szám/(FC-szám + CE-szám)] × 100. Az egér belében az orális beadás után kapott NBD-koleszterint hexán-vízzel (1: 1, 1 térfogat/térfogat), majd szilikagéllemezeken elválasztjuk petroléter-etil-éter-ecetsav (300: 150: 1,5, térfogat/térfogat/térfogat) oldószer-rendszer alkalmazásával. A mintákat a fluoreszcencia 450 nm-en történő mérésével vizualizáltuk, és densitometriával számszerűsítettük. Az észterezett NBD-koleszterin százalékos arányát a következő egyenlet alkalmazásával határoztuk meg: [CE fluoreszcencia/(FC fluoreszcencia + CE fluoreszcencia)] × 100.

A plazma szterin mennyiségi meghatározása.

Az NBD-koleszterin mennyiségi meghatározását egy korábban leírt módszer alapján alakítottuk ki (25). Röviden: az egyik napról a másikra éhező egereket 10% poloxamerrel (10 μl/g ip) injektáltuk a lipolízis és a keringő lipoproteinek kiürülésének gátlása céljából, majd azonnal orális [14C] koleszterin és 0,4 mg NBD-koleszterin olívaolajban tápláltuk őket. . Az egereket 4 óra elteltével izoflurán túladagolással eutanizáltuk. A vért szívpunkcióval vettük össze, majd a plazma izolálásához centrifugáltuk. A [14 C] koleszterin felszívódását 10 μl plazmaminták szcintillációs számlálásával számszerűsítettük. Az NBD-koleszterin mennyiségét 50 μl plazmaminta hexánnal és vízzel (1: 1, térfogat/térfogat) való extrahálásával határoztuk meg. A kivont lipideket 500 μl 10 mM taurocholate-ban oldjuk fluoreszcencia mérés céljából 485 nm gerjesztésnél és 535 nm emissziónál. Az egyes minták összes NBD-koleszterin koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a fluoreszcens intenzitást egy standard görbével.

Statisztikai analízis.

Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. Statisztikai szignifikancia (P +/+ és Npc1l1 -/- egereket orálisan beoltattunk egy NBD-koleszterinnel kiegészített olívaolaj bolus étkezéssel, majd 3 óra múlva eutanizáltuk, hogy értékeljük az NBD-koleszterin felvételét és transzportját a bélben./+ egereknél az orálisan beadott NBD-koleszterin elsősorban a bél proximális és középső szakaszának lamina propriájában található meg (1. ábra). Ezzel szemben az NBD-koleszterint nem figyelték meg az Npc1l1 teljes bélrendszerében -/- egerek (1. ábra).

22- (N (-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino) -23,24-bisznor-5-kolén-3β-ol (NBD-koleszterin) felvétele az enterocitákba Niemann-Pick C1 Like-1 (NPC1L1) protein-null (Npc1l1 -/-) és Npc1l1 +/+ egerek. Reprezentatív képeket mutatunk be 20 bélszakaszról Npc1l1 +/+ (balra) és Npc1l1 -/- (jobbra) egerekből (n = 10 egér csoportonként) 3 óra múlva, miután 0,4 mg NBD-koleszterinnel kezeltük 100 μl olívaolajban. A beleket 0,4% paraformaldehiddel rögzítettük, és a fluoreszcens mikroszkópia előtt optimális vágási hőmérsékletű (OCT) táptalajba ágyazottuk. Az NBD-koleszterin a lamina propriában lokalizálódik az Npc1l1 +/+ egerekben, de nem látható az Npc1l1 -/- egerekben.

NBD-koleszterin felvétele az Npc1l1 +/+ és az Npc1l1 -/- egerek enterocitáiba Pluronic L-81 jelenlétében. Az Npc1l1 +/+ (balra) és az Npc1l1 -/- (jobbra) egerek (n = 10 egér csoportonként) proximális (felső), középső (középső) és disztális (alsó) beléből 20 bélmetszetet mutatunk be. ) 3 óra múlva 3,45 mg Pluronic L-81-gyel, majd 0,4 mg NBD-koleszterinnel 100 μl olívaolajban történő beoltás után. A beleket 0,4% paraformaldehiddel rögzítettük, és fluoreszcens mikroszkópia előtt OCT táptalajba ágyazottuk. Az NBD-koleszterin mind az Npc1l1 +/+, mind az Npc1l1 -/- egerek bél lipidcseppjeiben található.

A koleszterint észterezzük Npc1l1 +/+ és Npc1l1// - egerekben. A: az Npc1l1 +/+ (szilárd rudak; n = 6) és az Npc1l1 -/- (nyitott rudak; n = 7) egereket 1 μCi [3 H] koleszterin-tartalmú táplálékkal etették 100 μl olívaolajban, és a beleket 3 óra múlva gyűjtöttük össze. A lipideket extraháltuk, és a koleszterin észterezés mértékét vékonyréteg-kromatográfiával határoztuk meg. A koleszterin észterezés százalékos arányát a [CE-számok ((FC-számok + CE-számok)]] × 100 értékkel határoztuk meg. B: Npc1l1 +/+ (szilárd oszlopok; n = 4) és Npc1l1 -/- (nyitott oszlopok; n = 5) egerek 0,4 mg NBD-koleszterinnel etettük 100 μl olívaolajban, és 4 óra múlva vért gyűjtöttünk. A plazma lipideket extraháltuk a koleszterin és a koleszteril-észterek vékonyréteg-kromatográfiás elválasztására. Az egyes sávokban jelen lévő NBD-koleszterin mennyiségét a fluoreszcencia intenzitásának 488 nm-en történő mérésével határoztuk meg. A százalékos észterezést [CE fluoreszcencia/(FC fluoreszcencia + CE fluoreszcencia)] × 100.

[3H] koleszterin felvétele az Npc1l1 +/+ és az Npc1l1 -/- egerek belébe. Az Npc1l1 +/+ (szilárd rudak) és az Npc1l1 -/- (nyitott rudak) egereknek 3,45 mg Pluronic L-81 dózist adtak, majd 1 μCi [3H] koleszterin szájon át történő adagolását 100 μl olívaolajban. A beleket eltávolítottuk, 100 mg-os részekre vágtuk, és a radioaktivitás meghatározása előtt feloldottuk szöveti szolubilizátorban. Az adatok átlagosan ± SE-t jelentenek 13 Npc1l1 +/+ és 10 Npc1l1 -/- egérből. * P +/+ egerek.

A Pluronic L-81 hatása a [3H] koleszterin éter és [14 C] koleszterin bélfelvételére. V: Az Npc1l1 +/+ egereknek 3,45 mg Pluronic L-81 dózist adtak, majd 1 μCi [14 C] koleszterin (szilárd rudak) és [3 H] koleszterin éter (nyitott rudak) szájon át történő adagolása következett. A beleket összegyűjtöttük, 100 mg-os részekre vágtuk, és a radioaktivitás meghatározása előtt feloldottuk szöveti szolubilizátorban. B: Az Npc1l1 +/+ egereknek sóoldat-dózist (kikelt rudak) vagy 3,45 mg Pluronic L-81-t (nyitott rudak) adtak, majd 1 μCi [3H] koleszterin-éter szájon át történő adagolásával. A beleket összegyűjtöttük, 100 mg-os részekre vágtuk, és a radioaktivitás meghatározása előtt feloldottuk szöveti szolubilizátorban. Az adatok mindegyik csoportban 3 egér átlagának ± SE értékét jelentik. * P 3 H] koleszterin felszívódási adatok.

Az NBD-koleszterin és a [14C] koleszterin felszívódása Npc1l1 +/+, Npc1l1 -/- és ezetimibével kezelt Npc1l1 +/+ egerekben. Az Npc1l1 +/+ (szilárd rudak; n = 5), az Npc1l1 -/- (nyitott rudak; n = 3) és az ezetimibével kezelt Npc1l1 +/+ (kikelt rudak; n = 4) egereknek 0,4 mg orális szondát adtak NBD-koleszterin és 1 μCi [14 C] koleszterin olívaolajban. A vért 4 óra múlva szívpunkcióval vettük fel. A plazmát hexánnal extraháltuk, és fluoreszcenciát mértünk az NBD-koleszterin abszorpció (A és B) kvantitatív meghatározásához. 10 μl plazmamintát számláltunk a radioaktivitás meghatározásához (C és D). Az adatok 5 Npc1l1 +/+, 3 Npc1l1 -/- és 4 ezetimibével kezelt Npc1l1 +/+ egerek átlagát ± SE-t képviselik. * P +/+ csoport.

VITA

TÁMOGATÁSOK

Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézet támogatta. RO1 DK-076907.

KÖZZÉTÉTELEK

A szerző (k) nem jelentenek be pénzügyi vagy egyéb összeférhetetlenséget.