Az NHR4 doménszerkezet megszakadása az AML1-ETO-ban megszünteti a SON kötődését és elősegíti a leukemogenezist

Szerkesztette: Stephen D. Nimer, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, és a szerkesztőség elfogadta 2008. szeptember 15-én (áttekintésre beérkezett 2008. március 18-án)

megszakadása

Absztrakt

  • AML1-ETO
  • Leukémia
  • NHR4
  • FIÚ
  • t (8; 21)

A kromoszóma transzlokáció az egyik leggyakoribb genetikai rendellenesség az akut mieloid leukémia (AML) esetében (1). Az AML1-ETO egy fúziós fehérje transzkripciós faktor, amely t (8; 21) (q22; q22) alapján keletkezik. Ezt a transzlokációt az esetek> 10% -ában és az AML francia-amerikai-brit M2 altípusának legfeljebb 40% -ában azonosítják (2–5). Az AML1-ETO expressziója azonban önmagában nem okoz leukémiát (6–11), ami azt sugallja, hogy az „AML1-ETO-pozitív sejtek számára további találatokra” van szükség ahhoz, hogy leukemogénekké váljanak.

Korábban csoportunk beszámolt arról, hogy az AML1-ETO (AML1-ETOtr) C-terminálisan csonka formája erősen leukemogén (12). Érdekes módon az AML1-ETO rövid változatát, az AML1-ETO9a-t, amelyet alternatív spliceléssel állítanak elő, t (8; 21) leukémiás betegmintákban azonosítottak, és az AML1-ETO9a expressziója egerekben gyors leukémia-fejlődést váltott ki (13). Az AML1-ETOtr és az AML1-ETO9a 556, illetve 575 aa (aa) kódolják, és hiányzik az NHR3 és az NHR4 régió. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ETO N-terminális része (NHR1 és NHR2) összeolvadva az AML1-gyel elegendő a leukémia kialakulásához. Ezenkívül az AML1-ETO C-terminális doménjei (NHR3 és NHR4) valóban szerepet játszhatnak a betegség kialakulásának elnyomásában.

Ebben a jelentésben bemutatjuk, hogy az NHR4 cink (Zn) kelátképző szerkezete felelős a leukémia kialakulását gátló hatások generálásáért, és hogy ez a régió kölcsönhatásba lép a SON-nal, egy potenciális DNS/RNS-kötő fehérjével, hogy növekedési leállást okozzon. AML1-ETO-t expresszáló sejtek. Továbbá bemutatjuk a SON döntő szerepét a sejtproliferációban és a SON rendellenes lokalizációját az AML1-ETO-t expresszáló leukémiás betegmintákban.

Eredmények

Az AML1-ETO NHR4 doménjének Zn-kelátképző szerkezetének törlése vagy megszakítása leukemogenezishez vezet.

Az NHR4 domén vagy az AML1-ETO NHR4 doménjének Zn-kelátképző maradékán lévő pontmutáció törlése a leukémia gyors kialakulását idézi elő. (A) Az AML1-ETO fúziós fehérje és a MigR1 retrovírus konstrukció sematikus ábrázolása. Három konstrukciót alkalmaztunk a retrovírusos fertőzés és transzplantációs kísérletek során: teljes hosszúságú AML-ETO (MigR1-AE), NHR4 domén deletált AML1-ETO (MigR1-AE-ΔNHR4) és AML1-ETO cisztein szerin szubsztitúciójával a.a. 663 (MigR1-AE-C663S). (B) A Zn-kelátképző struktúrák sematikus ábrázolása az AML1-ETO NHR4-ben. Az egyik Zn-kelátképző maradékot, a 663-as pozícióban lévő cisztein-maradékot (körrel jelölve) olyan pontmutációra választottuk, amely megzavarná az NHR4 domén Zn-kelátképző szerkezetét. (C) MigR1-AE, MigR1-AE-ANHR4 és MigR1-AE-C663S retrovirálisan transzdukált magzati májsejtekkel átültetett MF-1 egerek Kaplan-Meier túlélési görbéi. (D) A leukémiás egerekből származó, MigR1-AE-ΔNHR4-et tartalmazó perifériás vér EGFP-pozitív (EGFP +) és EGFP-negatív (EGFP-) populációiban expresszált származási markerek áramlási citometriás elemzése. Az egyes negyedek számai a cellák százalékos arányát képviselik.

A SON egy NHR4-kölcsönhatásban lévő fehérje.

Mivel a fenti transzplantációs kísérleteink azt mutatják, hogy az AML1-ETO NHR4 gyengíti az AML1-ETO leukemogenezisre gyakorolt ​​hatását, feltételeztük, hogy az NHR4 kölcsönhatásba léphet fehérjékkel, amelyek eltörlik az AML1-ETO leukémiát kiváltó képességét. Az NHR4-kölcsönhatásban lévő fehérjék kereséséhez két élesztő két hibrid szkrínelést végeztünk három csali felhasználásával, beleértve a teljes hosszúságú vad típusú ETO-t (ETO-wt), az ETO-t NHR4-ben mutáns pontmutációval (ETO-C663S) és a C-terminált. az ETO régiója (NHR3-NHR4) (2A. ábra). Egy olyan klónt izoláltunk, amely kölcsönhatásba lép az ETO-wt-vel és erősebben az NHR3-NHR4-gyel, de nem az ETO-C663S-sel. A szekvenciaelemzés során kiderült, hogy ez a klón egy 0,31 kb méretű inszert cDNS-t tartalmaz, amely az első 102 aa. egér SON fehérje (GenBank belépés NM_178880). A SON-ról beszámoltak arról, hogy rendelkezik DNS-kötő képességgel (16–18), és RNS-kötő motívumokat (19, 20) tartalmaz (részletek az S2. Ábrán), ami arra utal, hogy a SON kettős képességgel rendelkezhet mind a DNS-sel, mind az RNS-sel. . A SON funkciójáról azonban nem végeztek mélyreható vizsgálatokat.

A GST lehúzási kísérletek azt mutatták, hogy a SON a.a 1–81 fragmens, amelyet az 1. és 2. exon kódol, elegendő volt az ETO fehérjével való kölcsönhatáshoz (2B. Ábra). Ezenkívül az AML1-ETO-val transzfektált HeLa sejtekben az endogén SON kötődött a teljes hosszúságú AML1-ETO-hoz (S3. Ábra). Az endogén fehérjék közötti kölcsönhatást tovább erősítették egy t (8; 21) leukémiás betegből származó sejtvonalban, az SKNO-1-ben. A SON antitesttel végzett immunprecipitáció lehúzta az AML1-ETO-t az SKNO-1 sejtlizátumokban (2C. Ábra), bizonyítva, hogy a SON egy AML1-ETO-kölcsönhatásban lévő fehérje.

Elemeztük az AML1-ETO és a SON sejtes lokalizációját is immunfluoreszcens mikroszkóppal. Először az endogén SON lokalizációját vizsgáltuk. A foltos eloszlásban a magokban lokalizált SON, kizárva a DAPI-foltos DNS-ben gazdag régióból (S4. Ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi jelentésekkel, amelyek a SON lokalizációját mutatják az atomfoltoknál, az úgynevezett interkromatin granulátum klasztereknél (21). Annak megállapítására, hogy a SON kolokalizálódik-e AML1-ETO-val, a HA-jelölt AML1-ETO-t transzfektáltuk HeLa sejtekben, és a sejteket immunfestékkel láttuk el HA antitesttel és SON antitesttel. Kimutattuk az endogén SON és a HA-jelölt AML1-ETO kolokalizációját (2D. Ábra), bár nem minden AML1-ETO sonokalokalizálódott. Ezenkívül megállapították, hogy a SON kolokalizálódik a transzfektált ETO fehérjével (2D. Ábra).

Az ETO-C663S mutáció kiküszöböli a SON kölcsönhatást, de nem az N-CoR kölcsönhatást.

Mivel ismert, hogy az ETO NHR4 doménje kölcsönhatásba lép az N-CoR/SMRT-vel, teszteltük, hogy a cisztein 663 mutáns hibás-e az N-CoR kötésben is. A SON N-terminális fragmenst (a.a. 1-81) és az RIII domént tartalmazó N-CoR fragmenst (a.a. 975-1250) wt-ETO-val vagy ETO-C663S-sel transzfektáltuk. Az N-CoR RIII doménjében jelen lévő PPPLIP szekvenciáról beszámoltak arról, hogy kölcsönhatásba lép az ETO NHR3 és NHR4 területét felölelő régióval (14, 22). Azt azonban nem sikerült egyértelműen bizonyítani, hogy az NHR4 önmagában kölcsönhatásba lép-e az N-CoR RIII doménjével emlős sejtekben. Érdekes módon az ETO-C663S teljesen elvesztette interakcióját a SON fragmenssel, miközben megőrizte az N-CoR RIII doménnel való interakció képességét (3A. Ábra).

Az NHR4 vagy C663S mutáció törlése megszünteti a SON kölcsönhatást, az N-CoR kölcsönhatást azonban nem. (A) A C663S mutáció hatása a SON N-terminális fragmensével és az RIII domént tartalmazó N-CoR fragmenssel való kölcsönhatásra. A GST-jelölt SON-t (1–81 aa) és a HA-jelöléssel ellátott N-CoR-t (975–1250 aa) 293T sejtekbe transzfektáltuk, vagy Flag-tag-jelölt vad típusú ETO-val (WT), vagy ETO-val, C663S-mutációval, és immun-lecsapódott Flag-sel. ellenanyag. (B) Az NHR4 deléció vagy a C663S mutáció hatása a teljes hosszúságú SON-nal és az N-CoR-rel való kölcsönhatásokra. SON antitestet vagy N-CoR antitestet alkalmaztunk immunprecipitációra az endogén SON vagy N-CoR lehúzására, és immunblettel a Flag-tagjelölt ETO kimutatására; vad típusú ETO (WT), ETO C663S mutációval (C663S) és NHR4-deletált ETO (ΔNHR4).

Az NHR4 mutáció hatásának összehasonlítása a teljes hosszúságú SON-tal és a teljes hosszúságú N-CoR-rel való kölcsönhatásokra, a vad típusú ETO-t, az ETO-C663S-t és az ETO-ΔNHR4-et 293T sejtekben fejeztük ki, és a SON antitestet vagy az N-CoR antitestet immuncsapásra használtuk. A SON antitesttel kicsapott komplexben mind a SON, mind a vad típusú ETO-t kimutatták (3B. Ábra). Azonban sem az ETO-C663, sem az ETO-ΔNHR4 nem volt kimutatható szignifikánsan az immunprecipitátumokban (3B. Ábra). Ezzel szemben az N-CoR kölcsönhatást nem befolyásolta a deléció vagy a C663S mutáció az ETO NHR4 régiójában (3B. Ábra). Valószínű, hogy az N-CoR interakciót továbbra is az ETO más területei közvetítik, míg a SON interakcióhoz feltétlenül szükség van az ETO Zn-kelátképző topológiájára.

Az siRNS által történő SON-leütés jelentős növekedési leállást vált ki a sejtekben.

A SON siRNS teljesen lecsapja az endogén SON-t és növekedésgátlást indukál. (A) A SON leütése SON siRNS-ekkel 293T sejtekben, Northern-blottolással megerősítve. (B) A SON leütése Western-blot-módszerrel megerősítve. A K562 sejteket SON siRNS-sel transzfektáltuk. 1. Teljes sejt-lizátumokat állítottunk elő 3 nap múlva, és immunoblotoltunk SON antitesttel. (C) A SON siRNS növekedési leállást vált ki. A K562 sejteket 1,3 μM negatív kontroll siRNS-sel vagy három különböző SON siRNS-sel transzfektáltuk nukleofekcióval 100 μl oldatban, és a sejteket minden nap megszámoltuk. A grafikon négy kísérletet reprezentál. (D) Morfológiai változások a K562 sejtekben 3 nappal a SON siRNS (# 1) transzfekció után.

A SON N-terminális töredékének kifejezése megmenti az AML1-ETO által kiváltott növekedésgátlást.

Csak a siRNS által történő SON-leütés okozza a növekedés megállítását. Ezért egy másik megközelítést választottunk az AML1-ETO és a SON kölcsönhatásának blokkolására. Mivel a SON N-terminális régiója, amely megfelel az a.a. Az 1–81 elegendő volt ahhoz, hogy kölcsönhatásba lépjünk az AML1-ETO NHR4-gyel (2B. Ábra), túl expresszáltuk a SON N-terminális fragmentumát, hogy zavarjuk az AML1-ETO és az endogén SON kölcsönhatását. A megfelelő nukleáris lokalizáció biztosítása érdekében az első 140 a.a. a SON-ból (SON-140), amelynek feltételezett nukleáris lokalizációs jele van a.a. 117–128 (GenBank keresés alapján). Az immunfestéssel kiderült, hogy a SON-140 tökéletesen kolokalizálódik az endogén SON-nal (5A. Ábra). Ennek a SON-140 fragmensnek az expressziója hatékonyan gátolta az AML1-ETO és az endogén SON közötti kölcsönhatást (5B. Ábra).

Annak tesztelésére, hogy a SON N-terminális fragmens expressziója képes-e legyőzni az AML1-ET által indukált növekedési leállást, az indukálható AML1-ETO expresszióval (23) rendelkező U937 sejteket MigR1 (kontroll vektor) vagy MigR1-Flag-SON-140 fertőzéssel fertőztük. Tetraciklin jelenlétében (AML1-ETO nélkül) a kontroll sejtek és a Flag-SON-140-et expresszáló sejtek azonos növekedést mutattak (5.C ábra), ami megerősítette, hogy a SON siRNS-sel ellentétben a SON-140 maga nem befolyásolja a sejtek növekedését. Ezután tetraciklin hiányában tenyésztettük ezt a két populációt, hogy kiváltjuk az AML1-ETO expressziót. Amint arról korábban beszámoltunk, az AML1-ETO indukciója a MigR1 kontrollvonalban növekedési leállást okozott. A Flag-SON-140-expresszáló vonal növekedési leállást szenvedett a tetraciklin eltávolítását követő első 2-3 napban is, amikor az indukált AML1-ETO expresszió meghaladta a SON-140 expressziót (S5. Ábra). Azonban a MigR1 kontroll sejtekkel ellentétben ezek a sejtek a 4-5. Nap után kezdtek terjeszkedni, amikor az AML1-ETO indukció mérsékelt szinten van (S5. Ábra), és normális növekedési sebességet kaptak vissza (5C. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az AML1-ETO és az endogén SON közötti kölcsönhatás gátlása megmentheti a sejteket az AML1-ETO által kiváltott növekedési leállástól, ami arra utal, hogy az AML1-ETO és SON kölcsönhatás negatív hatást gyakorol a sejtek növekedésére.

A SON rendellenes lokalizációja az AML1-ETO-pozitív sejtvonalakon és a t (8; 21) AML betegmintákban.

A SON rendellenes citoplazmatikus lokalizációja t (8; 21) -pozitív leukémiás sejtekben. (A) Két t (8; 21) nélküli leukémiás sejtvonalat, K562 és U937, valamint két t (8; 21) leukémiás sejtvonalat, Kasumi-1 és SKNO-1 festettünk SON antitesttel és DAPI-vel (DNS-hez) . (B) Négy különböző AML-beteg vérsejtjeit SON antitesttel és DAPI-val festettük, és fluoreszcens mikroszkóppal elemeztük. 1. beteg, FAB M2 altípus, nem t (8; 21); 2. beteg, FAB M4 altípus, nem t (8; 21); 3. és 4. beteg, FAB M2 altípus, t (8; 21) -pozitív. A nyilak a citoplazmában lokalizált SON-t jelzik. A képek az egyes sejtvonalak jellegzetes jellemzőit mutatják, és a fluoreszcens mikroszkóppal elemzett> 1000 sejtből származó betegminták.

Ezután elemeztük a SON lokalizációját a betegek elsődleges AML sejtjeiben. Leukémiás blasztokat nem t (8; 21) AML betegek és t (8; 21) AML betegek véréből összegyűjtöttünk és immunfestést készítettünk SON antitesttel. Meglepő módon a t (8; 21) AML sejtek figyelemre méltó citoplazmatikus lokalizációt mutattak a SON-ban (6B. Ábra), ami még nyilvánvalóbb, mint a t (8; 21) -pozitív sejtvonalakban megfigyelhető. Képelemzés alapján a teljes SON mennyiség kb. 55 ± 7% -a helyezkedett el a citoplazmában. Ezzel szemben a nem t (8; 21) AML sejtek nem mutattak semmilyen SON fehérjét a citoplazmában (6B. Ábra). Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a SON rendellenes citoplazmatikus lokalizációja részt vesz a t (8; 21) asszociált AML-ben.

Vita

Mivel az AML1-ETO a C663S mutációval, amely kifejezetten megszakítja a kölcsönhatást a SON-nal, leukemogén, és a SON N-terminális fragmensének (SON-140) az AML1-ETO-hoz kötődő expressziója meggátolja a sejteket az AML1- ETO, nagyon megjósolható, hogy az AML1-ETO és a SON-140 együttes expressziója leukemogén lenne egerekben. Ha azonban az AML1-ETO expresszió meghaladja a SON-140 mennyiségét, a sejtek továbbra is növekedési leállást szenvednek (S5. Ábra), ami arra utal, hogy az AML1-ETO és a SON-140 relatív mennyisége fontos szempont lenne az egér modellnél az AML1-ETO és a SON-140 együttes expressziója. Jelenleg olyan módszert keresünk, amellyel ezt a két fehérjét megfelelő szinten együtt expresszálhatjuk az elsődleges vérképző sejtekben.

Érdekes meghatározni a citoplazmatikus SON pontos lokalizációját. Kísérleteket végeztünk annak megállapítására, hogy a citoplazmatikus SON a t (8; 21) -pozitív sejtekben lokalizálódik-e különösen a citoplazmatikus organellumokban, például az endoplazmatikus retikulumban (ER), a Golgiban és a lizoszómákban/endoszómákban. A SON nem kolokalizálódott ezen organellák egyikével sem (S8. Ábra), ami azt jelzi, hogy a citoplazmatikus SON nincs jelen az ER, a Golgi vagy a lizoszómák/endoszómák komponenseként, és a citoplazmában detektált SON fehérje nem csupán egy a SON leromlott formája. Érdekes módon a SON golgi markerrel (GM130) történő festése azt mutatta, hogy bár az elkülönített SON fehérje nincs pontosan kolokalizálva a Golgival, szomszédos a Golgival. Megállapítottuk, hogy a SON N-terminális fragmense (1–140 aa) elegendő ahhoz, hogy lokalizálódjon a magfoltoknál (5A. Ábra). Ezért lehetséges, hogy a citoplazmában kimutatott SON fehérje mutációval rendelkezik az N-terminális régióban, vagy olyan izoform, amely nem tartalmaz nukleáris lokalizációs jeleket. Mivel a SON C-terminális végén potenciális RNS-kötő motívumokat tartalmaz, valószínű, hogy a SON a citoplazmában található RNS-ekhez kapcsolódik. A nukleáris/citoplazmatikus SON funkcióját jelenleg vizsgálják.

Vizsgálatunk együttvéve azt bizonyítja, hogy az NHR4 normális működésének megzavarásával járó molekuláris események olyan másodlagos mutációk lehetnek, amelyek az AML1-ETO-val együttműködve elősegítik a leukemogenezist. Továbbá azonosítottunk egy NHR4-kölcsönhatásban lévő partner SON-t, egy olyan fehérjét, amely potenciális DNS-RNS kettős kötési képességgel bír, és kapcsolatot teremt a SON és a betegséget okozó faktor között. Az AML1-ETO NHR4 és a SON kölcsönhatása lehet az egyik olyan tényező, amely gátló hatást generál a leukémia kialakulására a sejtproliferáció blokkolásával. A t (8; 21) AML betegek vérsejtjeiben a SON lokalizációjának rendellenességeit először tanulmányunkban mutattuk be, amely új leukémia gyógyszer célpontot tár fel. A SON biológiai funkciójának tisztázására irányuló további vizsgálatok értékes betekintést nyújthatnak a sejttranszformáció és a rák kialakulásának szabályozásába.

Mód

Sejtvonalak és AML betegminták.

Kasumi-1, SKNO-1, K562, U937 és U937T-AML1-ETO tet-indukálható sejtvonalakat növesztettünk RPMI MEDIUM 1640, 293T és HeLa sejteket pedig Dulbecco módosított Eagle táptalajában, 10% (térfogat/térfogat) kiegészítéssel. FBS. Vérmintákat vettek újonnan diagnosztizált AML-ben szenvedő betegektől az Aarhusi Egyetemi Kórházban (Aarhus, Dánia). Minden mintavételt a diagnosztikai folyamat részeként hajtottak végre, az Aarhus megyei etikai bizottság által jóváhagyott protokollok szerint.

Magzati májsejtek izolálása, retrovírus-transzdukció, transzplantáció, hematológiai elemzés és áramlási citometria.

A magzati májsejteket E14,5 egér embriókból (MF-1) gyűjtöttük, MigR1 üres vektort, MigR1-AE-ANHR4 vagy MigR1-AE-C663S tartalmazó retrovírusokkal fertőztük, és a befogadó MF-1 egerekbe transzplantáltuk. Az eljárásokat a korábban leírt módon hajtották végre (12, 13).

Transzfekció, fertőzés és nukleofekció.

A 293T és HeLa sejtek transzfekcióját Polyfect (Qiagen) alkalmazásával hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk (30). A K562 és U937T sejtek fertőzését a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (31). A K562 sejtek nukleofekcióját a gyártó protokollja (Amaxa) szerint hajtottuk végre. A negatív kontroll siRNS-t (katalógusszám: 4621) és a SON siRNS-t (katalógusszám: 16708, siRNS azonosítószám: 143161, 143162, 143163) az Ambion cégtől vásároltuk, és a lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával a sejtekhez transzfektáltuk és a szuszpenzióhoz nukleofekciót használtunk. sejtek.

Két élesztő hibrid szűrés.

Az élesztő két hibrid szűrését a TetR-alapú két-hibrid rendszer (Proteinlinks Inc.) végezte az egér multipotenciális hematopoietikus prekurzor sejtvonalának, az EML cDNS-könyvtárának szűrésére (Dr. Schickwann Tsai ajándéka, Utah Egyetem, Salt Lake City, UT).

SON antitest előállítása.

Poliklonális antitestet termeltek nyulakban humán SON a.a. 2090–2107 (EEKVAKKSGGATIEELTE), és affinitáskromatográfiával tisztítottuk (Open Biosystems).

További részletek.

A kísérleti módszerekkel kapcsolatban további információk találhatók a SI-módszerekben.

Köszönetnyilvánítás

Hálásak vagyunk Dr. N. Specknek a kézirattal kapcsolatos értékes javaslataiért. Köszönjük Dr. S. Hiebert (Vanderbilt Egyetem) és B. Meyer (Brown Egyetem) plazmidok biztosításáért, Dr. S. Tsai (Utahi Egyetem) az egér EML sejtvonal cDNS könyvtáráért és Kasusa DNS Kutató Intézet, Kisarazu, Chica, Japán, a KIAA1019 cDNS-hez. Köszönetet mondunk Dr. J. Biggs-nek a kézirat kritikai szerkesztéséért. Ezt a munkát a Nemzeti Egészségügyi Intézetek CA096735 és CA104509 (DEZ-nek), a Lady TATA Memorial Trust Award ösztöndíj (EYA), valamint a Dán Rákellenes Társaság és a Dán Orvosi Kutatási Tanács (PH) támogatásával támogatták. . Ez a Scripps Research Institute 18734-es kézirata.

Lábjegyzetek

    1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: d7zhangucsd.edu

Szerzői hozzászólások: E.-Y.A., M.Y. és D.-E.Z. tervezett kutatás; E.-Y.A., M.Y., O.A.M., M.-C.L., A.B. és R.H. kutatást végeztek; H.B.O. és P.H. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; E.-Y.A., M.Y. és D.-E.Z. elemzett adatok; és E.-Y.A. és D.-E.Z. írta a lap.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

Ez a cikk a PNAS közvetlen benyújtása. S.D.N. a szerkesztőbizottság által meghívott vendégszerkesztő.