Az oxalát a II. Típusú hám és a mezenhimális átmenetet (EMT) indukálja a belső medulláris gyűjtőcsatorna sejtekben (IMCD) in vitro és serkentik az osteogén és fibrotikus markerek expresszióját a vese medullájában in vivo

Mutatók: PDF 1284 megtekintés | Teljes szöveg 1058 megtekintés | ?

Marcia Convento _, Edson Pessoa, Alef Aragão, Nestor Schor és Fernanda Borges

Absztrakt

Marcia Convento 1, Edson Pessoa 1, Alef Aragão 2, Nestor Schor 1 és Fernanda Borges 1, 2

1 Nefrológiai osztály, Orvosi Tanszék, São Paulo Szövetségi Egyetem, São Paulo, SP, Brazília

2 Interdiszciplináris posztgraduális program az egészségtudományban, Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, SP, Brazília

Kulcsszavak: epitheliális és mesenchymalis átmenet; oszteogén differenciálás; oxalát; TGF-p1; vese velő

Beérkezett: 2018. július 25. Elfogadva: 2019. január 12. Megjelenés: 2019. február 01

BEVEZETÉS

Az oxalát (Ox) az anyagcsere rendszeres mellékterméke, és az előállított kis mennyiség általában ártalmatlanul ürül a vizelettel. Mindazonáltal az oxalát (Ox) fokozott vizeletürítése a genetikai (primer hiperoxaluria) és a környezeti tényezők (idiopátiás hiperoxaluria), az oxalátban gazdag ételek elfogyasztása (másodlagos hiperoxaluria), a jejunális bypass műtét és a modern gyomor bypass következtében kialakuló zsír felszívódási zavar következtében enterális hiperoxaluria) [1, 2] urolithiasishoz, nephrocalcinosishoz, pyelonephritishez, hydronephrosishoz, fibrózishoz és veseelégtelenséghez vezethet [3, 4].

Sokféle állatmodellt fejlesztettek ki a hiperoxaluria és annak következményeinek vizsgálatára. Az etilénglikol [5] és a HPL [3] által kiváltott hiperoxaluria állatmodellben a tubulointerstitialis terület súlyos károsodását találták. Ezeket az elváltozásokat a tubuláris hámsejtekrózis, a tubuláris lumenekben lévő kalcium-oxalát kristálylerakódások és a gyulladásos infiltrátumok, a lipid peroxidáció és a rezidens intersticiális sejtek, például a fibroblasztok szaporodása, valamint az extracelluláris mátrix komponensek, köztük a kollagén rostok növekedése jellemezte [1 6–8].

Kimutatták, hogy az oxalát toxikus a kérgi eredetű vese hámsejtekben [9–13]. Azonban a belső medulláris gyűjtőcsatorna (IMCD) sejtek, amelyek fiziológiailag ki vannak téve az oxalát nagyobb koncentrációinak, másképp viselkedhetnek. Ezek a sejtek egyedülálló környezetben élnek túl a szervezeten belül, általában kitéve az ozmolalitás, a pH és a toxinok egyébként halálos végleteinek. Maroni et al. [14] kimutatta, hogy a sertés proximális tubuláris sejtjei (LLC-PK1) és az emberi vese proximális tubuláris sejtjei (HK-2) jelentősen megsérültek alacsonyabb nátrium-oxalát-koncentrációknál, mint az IMCD-sejtek. Ezenkívül Brady et al. [15] szerint a HK-2 sejtek érzékenyebbek, mint az IMCD sejtek, a ciszplatin citotoxicitásra in vitro, megerősítve azt az elképzelést, hogy az IMCD sejtek viszonylag jobban ellenállnak a toxicitásnak. Mindazonáltal az IMCD sejtek nem lehetnek inertek az oxaláthatásokkal szemben, és fenotípus-átmenetek és oszteogén szerzési jellemzők révén részt vehetnek a nephrolithiasisban, amint azt a hiperoxalurikus egereknél nemrégiben bemutatták. in vivo [16].

Csoportunk egy másik vizsgálata kimutatta, hogy az oxalátionok a humán proximális tubuláris hámsejtekbe (HK-2) expozícióval stimulálták a 2-es típusú hám-mesenchymalis átmenetet (EMT) [17].

Az 1-es típusú EMT normális organogenezis során fordul elő. A 2. típusú EMT a sebgyógyuláshoz, a szövetek regenerálódásához és a szervi fibrózishoz társul. A 3. típusú EMT kapcsolatban áll azzal, hogy a neoplasztikus sejtek a környező szövetekbe vándorolhatnak, és metasztázis helyeken behatolhatnak [18–20].

A 2-es típusú EMT a szövetek regenerációja során a hámsejtek plaszticitásának és a szervi fibrózis alapvető megnyilvánulása, amely szövetjavító válaszokkal, például a szervek mögöttes sérüléseinek fibrózisával társul. Vesefibrózis esetén, ha a sérülés enyhe és akut, a gyógyulási folyamatot reparatív fibrózisnak tekintik; éppen ellenkezőleg, folyamatos krónikus gyulladás esetén a myofibroblastok kóros képződése, fokozott motilitással, extracelluláris mátrixfehérje szintézissel, proliferációval és invazivitással jellemezve [18–20].

A hámsejt-markerek expressziójának elvesztése egyidejűleg, és ezek hajtóerejeként jelentkezik. A hámsejtek felépítése és állandósága a szoros csomópontok lezárásakor az E-kadherint tartalmazó sejt-sejt kontaktusoktól függ. A sejt-sejt adhézió támogatása mellett a kadherinek a sejtfunkciók széles skáláját befolyásolhatják, ideértve a sejtjelző útvonalak aktiválását, a citoszkeleton szabályozását és a sejtpolaritás szabályozását [18–20].

A transzdifferenciálódott hámsejtek elveszítik meghatározott sejt-sejt-bazális membrán érintkezéseiket, és szerkezeti/funkcionális polaritásuk orsó alakúvá és morfológiailag hasonlóvá válik az aktivált fibroblasztokhoz. Vannak mesenchymális markerek, amelyek a 2-es típusú EMT-ben expresszálódnak, mint α-SMA, amely mikrofil myofibroblast marker. Egy másik bemutatott mezenhimális marker a Vimentin, egy köztes filamentum, amelynek expressziója közvetlenül kapcsolódik a sejt fenotípusos változásaihoz [18–20].

A 2. típusú EMT feltehetően valamilyen stresszes környezeti ingerre reagál, mint mechanikus nyújtás [21], toxicitás ciklosporin kezeléssel [22], fejlett glikációs végtermékeknek való kitettség (hiperglikémia AGE-következménye) [23] és oxidatív stressz [ 24].

Bizonyított, hogy néhány oldható növekedési faktor, citokin és extracelluláris fehérje befolyásolja a 2-es típusú EMT-t és befolyásolja a vesebetegség progresszióját. Úgy tűnik azonban, hogy a transzformáló növekedési faktor béta (TGF-β1) kiemelt szerepet játszik, és a vesebetegség progresszív formáiban szinte univerzálisan növekszik az expresszió [25, 26]. Valójában a TGF-β1 a sejtplaszticitás genetikai programját indukálhatja, amely magában foglalja az epitheliális differenciálódás, a citoszkeletális átszervezés és a proliferáció legfontosabb útjait és szabályozóit. A TGF-β1 indukálja a fibrotikus gének expresszióját, és közvetíti a glomeruláris és tubuláris sejtek apoptózisát, azt a mechanizmust, amellyel a tubuláris hámsejtek egy myofibroblastikus fenotípust nyerhetnek el, amely nélkülözhetetlen a fibrózis patogeneziséhez [27–29].

A 2-es típusú EMT-t már bizonyították az IMCD sejtekben in vitro, epidermális növekedési faktor receptorral [30], Bestrophin-1 [31], TGF-β1 [32], inzulinszerű növekedési faktorokkal [32] és növekedési differenciálási faktor-11 [27] expozícióval. In vivo kísérletek azt mutatták, hogy a veleszületett húgyúti elzáródás embereknél [33] és állatoknál [34] a gyűjtőcsatorna hámsejt sérülésében és a 2. típusú EMT-ben. Azonban a medullaáris gyűjtőcsatornában a 2-es típusú EMT oxalát-indukciója, amely nem mesenchymalis metanephricából, hanem ureterbimbóból származik, nem bizonyított.

A hiperoxalurikus patkányok mind a vesekéregben, mind a medullában fokozták a mezenhimális markerek és az oszteogén marker gének növekedését [16]. Így ez a tanulmány azt sugallja, hogy az oxalátionok indukálhatják a 2-es típusú TEM-et az IMCD-sejtekben, és hogy ezeket a transzformált sejteket stimulálni lehet az oszteogén markerek expresszálására. in vitro. Az oxalát hatása in vivo az egerek vese medulláján is értékelni fogjuk.

EREDMÉNYEK

Annak eldöntésére, hogy az Ox és TGF-β1-nek kitett IMCD-sejtek aktívabbak lettek-e az invázióban, mint a kontroll sejtek, a mesenchymális sejtek ezt a jellemzőjét értékeltük a transzwell-kamra assay segítségével.

Amint az 1A. Ábrán látható, az 0,5 mM Ox (0,246 ± 0,003 DO) és a 20 ng/ml (0,285 ± 0,006 DO) oxigénnek kitett IMCD sejtek gyorsabban behatoltak a pórusokon, mint a kontroll sejtek (0,132 ± 0,005 DO). A sejtszintű inváziós kapacitás megszerzése jellemző a 2. típusú TEM-re. Az Ox (0,5 mM) csoport megszerzi ezt a képességet, valamint a TGF-β1-stimulált csoport (pozitív kontroll), amelyet a 2. típusú TEM fő mediátorának tekintenek [35, 36]. Figyelembe véve, ezek a csoportok megmaradtak vizsgálati modellünkben.

Oxalátionok előállítása

Dikálium-oxalát (0,4 M, 100 ml) (Merck, Darmstadt, Németország) oldatait 300 ml desztillált, ioncserélt vízhez adtuk állandó, 1 ml/perc csepegési sebességgel 2 órán át. Ezt a szuszpenziót 5 órán át folyamatosan keverjük 75 ° C-on, majd ionmentes vízzel mossuk a kálium-klorid eltávolítása céljából. Oxalátot (10 mM) adunk a foszfáttal pufferolt sóoldathoz (PBS-mentes kalcium), 0,22 μM szűrőben sterilizáljuk, és a megfelelő protokollokban 0,5 mM (48 óra) koncentrációban használjuk. Az 1. kiegészítő ábrán a sejteket 1,0 Mm-nek (48 óra) tesszük ki, azonban vizsgálatunkban nem használtuk.

Az IMCD immortalizált sejtjeinek kitettsége oxalátionoknak (0,5 mM), exogén TGF-β1-nek (20 ng/ml) és NAC-nak (10 mM).

A kísérletek előtt az immortalizált sejteket (amerikai típusú tenyésztési gyűjtemény (ATCC)) 2 napig tenyésztési körülmények között tartottuk. Összefolyáskor az IMCD-t 48 órán keresztül DMEM-nek (5% FBS, kontroll), oxalátot (0,5 mM) tartalmazó TEM-t tartalmazó DMEM-nek, 20 ng/ml TGF-β1-nek (20 ng/ml, Peprotech, NJ, USA) használtuk, mint pozitív kontrollt. 2 TEM és N-acetil-cisztein (10 Mm, Sigma, St. Louis, MO, USA). A kísérleti protokollt legalább háromszor megismételtük különböző időszakokban. N = 5 minden csoportra.

Inváziós vizsgálat

Az IMCD invázióját transz-kút vizsgálattal elemeztük; 105 sejtet adtunk a 6 üregű transz-üreges lemezek felső kamráihoz (8 μm méretű, Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA), és az 5% oxigént és TGF-β FBS-t tartalmazó táptalajt az alsó kamrákhoz 48 óra. A felső (nem invazív) sejteket eltávolítottuk, az alsó (invazív) sejteket 3,7% -os formaldehidben rögzítettük, Trypan Blue-val festettük, 2% nátrium-dodecil-szulfátban oldottuk és az abszorbanciát 620 nm-en rögzítettük. Mindezeket a vizsgálatokat három példányban végeztük.

Immunfluoreszcencia

Az IMCD sejteket 8 lyukú Labtek II üveglemezeken növesztettük, majd PBS-sel mostuk, fixáltuk (3,7% friss paraformaldehid PBS-ben 20 percig szobahőmérsékleten), permeabilizáltuk (0,5% Triton X-100 5 percig), 5-szel blokkoltuk. % albumin/foszfátpufferolt sóoldat (BSA/PBS) 60 percig. Blokkolást követően primer patkány monoklonális antitestek (Santa Cruz). 1: 50 arányban E-kadherinhez α-SMA-t és Vimentint adtunk egy éjszakán át 4 ° C-on, 0,5% BSA/PBS-ben. A FITC-jelölt másodlagos anti-patkány IgG-t és anti-egér IgG-t (1: 100) (Santa Cruz) 2 órán át szobahőmérsékleten 0,5% BSA/PBS-ben adtuk hozzá, és a sejteket DAPI-vel (4′6-diamidino 2-fenilindol, Sigma) 10 μg/ml. A takarólemezeket pufferolt glicerinnel ellátott üveglemezekre rögzítettük és Nikon fluoreszcens mikroszkóppal elemeztük. A kapott mikroszkóp képeket ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük. Az adatokat a pozitív fluoreszcencia intenzitás százalékos arányában adjuk meg területenként [62].

Migrációs vizsgálat

A sebgyógyulási vizsgálatot általában használják a pro és a migrációellenes szerek tenyésztett sejtekre gyakorolt hatásának értékelésére [63]. Röviden, a sejteket tenyésztett műanyag edényekben összefolyásig tenyésztettük, körülbelül 5x106 sejt/üreg sűrűségűvé. 24 órás nyugalom után a sejteket eltávolítottuk egy gumirendőr áthúzásával a lemez közepén. A tenyészeteket PBS-sel öblítettük, és 5% FBS-t tartalmazó friss táptalajjal helyettesítettük (kontroll helyzet), és az 5% FBS-t tartalmazó táptalaj oxigént (0,5 mM) és TGF-β1-et (20 ng/ml) adott, ezt követően az IMCD-sejteket 37 ° C-on 48 órán át, és fényképeztük.

Valós idejű polimeráz láncreakció (valós idejű PCR)

A teljes ribonukleinsavat (RNS) (IMCD sejtek és egerek vese vese) tisztítottuk fenol és guanidin izotiocianát-cézium-klorid módszerrel, megfelelő készlet alkalmazásával (Trizol, Life Technologies, USA). 2 mikrogramm teljes RNS-t kezeltünk DNázzal (RQ1 RNáz-mentes DNáz, Promega), hogy megakadályozzuk a genomiális dezoxiribonukleinsav szennyeződést. Az RNS-pelletet RNáz-mentes vízben szuszpendáltuk. Reverz átíródás cDNS-be 0,5 mg/ml oligo d (T), 10 mM DTT, 0,5 mM dNTP (Pharmacia Biotech) és 200 U reverz transzkriptáz enzim (SuperScript RT, Gibco-BRL) tartalmú keverék hozzáadásával. A valós idejű amplifikációt GeneAmp 7700 szekvencia detektáló rendszer (SDS, ABI Prism 7700, Applied Biosystems) segítségével nyertük, és a SYBR Green I interkalációs festékkel (Applied Biosystems) figyeltük. A PCR-t szelektív primerekkel végeztük (1. kiegészítő táblázat). Az eredményeket a β-aktin háztartási génnel normalizált relatív expresszióként közöltük. A hajtásvariációt a 2- (ΔΔCt) módszerrel határoztuk meg, a korábban publikált protokoll szerint [64].

Osteoindukciós vizsgálat

Az IMCD sejteket 48 órán át DMEM-nek (5% FBS, kontroll), oxalátot tartalmazó DMEM-nek (0,5 mM) és TGF-p1-nek (20 ng/ml) tettük ki. Ezen időszak után a sejteket egy oszteogén kondicionált táptalajon tettük ki, beleértve az 5% FBS-t tartalmazó α-MEM-et, 50 μg/ml aszkorbinsavat (Gibco), 10 mM b-glicerin-foszfátot (Gibco) és 10 nM dexametazont (Sigma), 15 napos tenyésztés osteogen kondicionált táptalaj napi cseréjével. A teljes RNS-t (Real-Time PCR) kivontuk a Runt-rokon transzkripciós faktor 2 (RUNX-2) és az alkalikus foszfatáz (ALP) oszteogén markerek expressziójának kimutatására. A 15. napon az extracelluláris mátrixfestéket (Alizarin Red S) hozzáadtuk a lemezekhez tenyésztés közben, és a képeket minden csoportban lefényképeztük.

In vitro peroxidációs vizsgálat (tiobarbitursav-reaktív anyagok - TBARS)

A malondialdehid (MDA) a tiobarbitursavval (TBA) kombinálva vörös vegyületet képez, amelynek koncentrációját spektrofotometriával értékeltük 535 nm-en leolvasva [65]. A fenol nélküli táptalajt és a sejttenyészetek sejthomogenát mintáit oxaláttal (0,5 mM) és TGF-β1-gyel (20 ng/ml) stimuláltuk, a NAC (10 mM) távollétében és jelenlétében 48 órán keresztül. A NAC-val történő kiegészítés biztosítja az L-cisztein szulftiolcsoportját, és antioxidáns hatást fejt ki a szabad gyökök közvetlen eltávolításával is. Sejtes homogenizátumokat úgy kapunk, hogy a sejteket PBS-sel selejtezzük a lombikból. A mintákat 0,375% TBA, 15% triklór-ecetsav és 0,25 HCl (Sigma Chemicals) oldatához adtuk, folyamatos keverés közben tartottuk, 20 percig 95 ° C-on hevítettük, majd szobahőmérsékletre hűtöttük. A fehérje koncentrációt Lowry módszerével igazoltuk [66]. Pozitív kontrollt kaptunk, ha a sejtmintákat H2O2-val 1% -ban 1 órán át inkubáltuk a vizsgálat előtt. Az eredményeket a fehérje segítségével korrigáltuk, és μM/mg-ban fejeztük ki.

Western blottolás

A fehérje koncentrációt Lowry módszerével igazoltuk [66]. Az IMCD sejteket lemezenként 200 μl RIPA lízispufferrel (100 mm2) lizáltuk. A lizátumokat 12 000 g-vel 5 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, és a felülúszókat -80 ° C-on tároltuk. A fehérjéket (30 μg) 10% -os poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk és Mini Trans-Blot elektroforetikus transzfer cellával (BioRad) vittük át polivinilidén-fluorid membránokra. A nem specifikus kötőhelyeket 5% BSA-val (v/v) blokkoltuk TBS pufferben. Az immunblotokat egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a TGF-p1 és a GAPDH primer antitestekkel (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Háromszor TBS-T-vel végzett mosás után a membránokat 1 órán át inkubáltuk 4 ° C-on HRP-konjugált másodlagos antitestekben (1: 30000; Cell Signaling). Az immunreaktív fehérje sávokat Pierce ECL Plus Chemiluminescent szubsztrát detektáló reagensekkel (Thermo Fisher, USA) vizualizáltuk. A képeket egy Alliance 7 Chemiluminescence dokumentációs rendszerrel (UVItec, Cambridge, Egyesült Királyság) elemeztük. Az immunblot sáv intenzitásait ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük, és TGF-β1/GAPDH arányban fejeztük ki.

In vivo kísérleti csoportok

A kísérleti protokollt a São Paulo-i Szövetségi Egyetem Etikai Bizottsága (CEP 1098/10 számú dokumentum) hagyta jóvá, szintén egyetértésben a tudományos állatgondozásra és állatok felhasználására vonatkozó brazil irányelvekkel [67, 68]. A C57Bl/6 egereket a következő csoportokra osztottuk: egy kontroll csoport, amely vizet kapott ad libitum 60 napig; egy HPL csoport, amely 60 napig 5% HPL-t kapott ad libitum. A kísérleti protokoll 60 nap múlva befejeződött, az egereket 24 órán át metabolikus ketrecekben tartották a vizeletgyűjtés céljából, majd toxikus dózisú érzéstelenítő (ketamin és xilazin) alkalmazásával felölték őket. A veséket szövettani elemzés céljából eltávolították. A vizelet mennyiségét az oxalát kiválasztás elemzéséhez mértük. A kísérleti protokollt háromszor megismételtük különböző pillanatokban N = 5 minden csoportra.

Vizelet-oxalát

Oxalát-oxidáz készlettel (Trinity Biotech, Co. Wicklow, Írország) elemeztük a gyártó protokolljának megfelelően. Az eredményeket a vizelet térfogatán keresztül korrigáltuk, és mMol/24 órában fejeztük ki.

Vizeletkristályok

A vizelet üledékét centrifugálással nyertük (2300 fordulat/perc 5 percig), majd egy Neubauer-kamrában számoltuk a következő képlet szerint: (végső térfogat × kristályok száma)/(kezdeti térfogat × 0,0001) és lefényképeztük. Az eredményeket vizeletkristály/ml-ben fejeztük ki.

Hisztokémiai vizsgálat

A paraffin metszeteket xilol és alkohol gradiens oldatoknak, antigén visszanyerés, fehérje blokkolásnak és primer nyúl anti-TGF-p1 (1: 100, Santa Cruz, USA) inkubálásnak vetettük alá egy éjszakán át 4 ° C-on. Ezen időszak után a metszeteket peroxidáz antitesthez konjugált dextrán polimerrel inkubáltuk 30 percig (DAKO Envision kit, Dako, Dánia). A jelölést a metszetek kromogén szubsztráttal történő kitételével detektáltuk. Az elsődleges antitestet negatív kontrollként kihagytuk, és a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük, és fénymikroszkóp alatt elemeztük az Olympus BX 60 modellt 20x vagy 40x nagyítással. A vese paraffin szakaszát picrosirius vörös színnel festettük és polarizált fénymikroszkóppal (Olympus BX 60) kvantifikáltuk a kollagén típusok (I. típusú sárga-vörös tónus és III. Típusú zöldes tónus) termelésének értékelése céljából. A kapott mikroszkóp képeket ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük, és a festett terület% -ában fejeztük ki.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A statisztikai elemzést egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük, amelyet post-hoc Tukey-teszt követett, o-értékek ->