Az RCM-107 súlycsökkentő kínai gyógynövény formula gátló hatása a hasnyálmirigy α-amiláz aktivitására: enzimatikus és in silico megközelít

Szerepek Konceptualizálás, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti tervezet

rcm-107

RMIT Egyetem Egészségügyi és Orvostudományi Egyetem, Victoria, Ausztrália

Szerepek Formális elemzés, finanszírozás megszerzése, módszertan, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

RMIT Egyetem Egészségügyi és Orvostudományi Egyetem, Victoria, Ausztrália

Szerepek Módszertan, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Tartozéktudományi Kar, RMIT Egyetem, Victoria, Ausztrália

Szerepek Szoftver, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Tartozéktudományi Kar, RMIT Egyetem, Victoria, Ausztrália

Szerepek Konceptualizálás, módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

RMIT Egyetem Egészségügyi és Orvostudományi Egyetem, Victoria, Ausztrália

Szerepek Konceptualizálás, validálás, írás - áttekintés és szerkesztés

RMIT Egyetem Egészségügyi és Orvostudományi Egyetem, Victoria, Ausztrália

Szerepek Módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Endokrin tagsági osztály, Vietnami Katonai Orvostudományi Egyetem, Hanoi, Vietnam

  • Shiqi Luo,
  • George Binh Lenon,
  • Harsharn Gill,
  • Andrew Hung,
  • Daniel A. Dias,
  • Mingdi Li,
  • Linh Toan Nguyen

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Luo S, Lenon GB, Gill H, Hung A, Dias DA, Li M és mtsai. (2020) Az RCM-107 súlycsökkentő kínai gyógynövény formula gátló hatása a hasnyálmirigy α-amiláz aktivitására: Enzimatikus és in silico megközelítések. PLoS ONE 15 (4): e0231815. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231815

Szerkesztő: Jie Zheng, Akroni Egyetem, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2019. szeptember 25 .; Elfogadott: 2020. március 27 .; Közzétett: 2020. április 29

Adatok elérhetősége: Minimálisan anonimizált adatok állnak rendelkezésre támogató információs fájlként (S1 protokoll. Alfa-amiláz vizsgálati protokoll, S2 adatkészlet. Alfa-amiláz vizsgálati adatkészlet, S1 minőségértékelés. Az összes használt gyógynövény minőségértékelése). A dokkoló szoftvereket megosztották úgy, hogy letöltési linkjeiket megadták a kéziratban. A protokoll felkerült a Protocol.io webhelyre is: https://www.protocols.io/private/AFCFDB071C9E11EAA1240242AC110002.

Finanszírozás: Ezt a kutatási projektet az RMIT Egyetem Egészségügyi és Orvostudományi Karának Magvetési támogatása (341333) és a Tong Lee Pty Ltd (RE-0256) támogatja. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők elolvasták a folyóirat politikáját, és ennek a kéziratnak a szerzői a következő, egymással versengő érdekekkel rendelkeznek: Tong Kang Lee Kínai Orvosi Központ támogatta ezt a tanulmányt. Ez azonban nem változtatja meg az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását. Ehhez a kutatáshoz nincsenek szabadalmak, fejlesztés alatt álló termékek vagy forgalmazott termékek.

Bevezetés

Az elhízást az Obesity Society (TOS) krónikus betegségként határozta meg 2018-ban, annak kialakuló epidemiológiai tendenciája miatt [1]. Növeli más anyagcserezavarok kialakulásának kockázatát, mint például a magas vérnyomás, a 2-es típusú cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek és a szívinfarktus [2, 3]. Évente legalább 2,8 millió felnőtt hal meg túlsúlya vagy elhízása miatt [4]. Világszerte több mint 1,9 milliárd felnőtt volt túlsúlyos, míg több mint 650 millió felnőtt elhízott 2016-ban [4].

Jelenleg különféle terápiás célpontok állnak rendelkezésre a súlycsökkentéshez, például hasnyálmirigy-lipáz, alfa-amiláz, glukagon-szerű peptid-1 (GLP-1) receptor és szerotonin 2C-receptor [5–7]. A központi idegrendszerre (CNS) ható étvágycsökkentők használatának általános csökkentésével együtt pl. A periférián ható gyógyszerek, a fenfluramin, a d-fenfluramin és a rimonabant [5] szélesebb körben elterjedtek [5]. Egyes perifériás gyógyszerek sikeresek a súlykezelésben enyhe intoleranciával, különösen azok, amelyek csökkentik a tápanyagok emésztését és felszívódását [6].

Emberben a szénhidrátok különféle formái a teljes kalóriabevitel 40-80% -át teszik ki [5, 6]. Alacsony GI-tartalmú ételek (GI-érték ® Phaseolus vulgaris fehér bab kivonat az emberi klinikai vizsgálatok során súlycsökkentő hatást mutatott amilázgátló aktivitása révén [10].

A kínai gyógynövénykészítmények olyan terápiás gyógynövények, amelyeket hagyományosan kombinációban, nem pedig egyenként alkalmaznak. Számos in vitro és in vivo tanulmány [11–16] bebizonyította a növényi tápszerek szinergetikus hatását, jelezve, hogy a gyógynövényes tápszerek szignifikánsan jobb farmakológiai hatásokat mutatnak, mint az egyes gyógynövények különböző körülmények között, beleértve az elhízást is [17]. Park és mtsai. [15] két gyógynövény (Panax ginseng és Veratrum nigrum) erőteljes súlycsökkentő hatásáról számolt be, amelyeket a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott egereknél kombinációban, nem pedig külön-külön használtak. Az aktív osztályok, például egy adott növényi gyógyszer fenol- és flavonoidtartalma, felelősek lehetnek szinergetikus hatásaikért [17]. Kihívás azonban ezeket a szinergikus hatásokat pontosan értékelni, mivel a kínai gyógynövények pontos kémiai és farmakológiai tulajdonságai nincsenek egyértelműen meghatározva [18]. Integrált szisztematikus elemzési megközelítést fejlesztettek ki, beleértve az irodalmat, a kísérleti és a számítási vizsgálatokat is a komplex multi-ligandumok és célpontok szinergikus hatásainak elemzéséhez [17, 18].

Ezenkívül a molekuláris dokkolást általában használják a gyógyszertervezés során, amelynek célja egy ligandum célfehérjével való kötődési helyeinek előrejelzése. A ligandum hatása a célfehérjére megjósolható úgy, hogy összehasonlítjuk annak kötődési helyét egy bevált gyógyszerrel (például inhibitorral), amelynek ismert hatása van a fehérjére. Szintén molekuláris dokkolást alkalmaztak azon kulcsfontosságú aktív vegyületek azonosítására, amelyek az ismert aktív helyen a megfelelő célpontokhoz képesek kötődni [18].

Ebben a cikkben megvizsgáltuk az RCM-107 formulát (Slimming Plus), amelyet a korábbi tanulmányozott RCM-104 képletünkből módosítottunk, és amely klinikai vizsgálatok során jelentős hatást mutatott a fogyásra [19]. Az RCM-107 nyolc kínai gyógynövényt tartalmaz, köztük a Camellia sinensis/Lu cha ye; Poria/Poria cocos (schw.) Farkas./Fu ling; Nelumbinis folium/Nelumbo nucifera Gaertn./Ő ti; Alismatis rizóma/Alisma orientalis (sam.) Juzep./Ze xie; Plantaginis sperma/Plantago asiatica L./Che qian zi; Cassiae sperma/Cassia obtusifolia L./Jue ming zi; Sophorae flos/Sophora japonica L./Huai hua és Gardeniae fructus/Gardenia jasminoides Ellis./Zhi zi [20]. Nemrégiben végzett munkánk kimutatta, hogy ennek a képletnek erős hasnyálmirigy-lipáz gátló hatása van, ami a lipid felszívódás csökkenéséhez, így fogyáshoz vezethet. Emellett azonosítottuk hat aktív kémiai vegyület jelenlétét az RCM-107-ben és a rokon egyedülálló gyógynövényekben, mint például az EGCG, az epikatechin-3-gallát (EKG), (-) - epikatechin (EC), a kaffien, a rutin és a krocin [21 ]. A mai napig azonban nincs publikált tudományos bizonyíték arra vonatkozóan, hogy az RCM-107 és egyes növényi összetevői milyen hatással lennének a hasnyálmirigy alfa-amiláz aktivitására.

Ezért a jelen tanulmány célja először meghatározni az RCM-107 és az ebben a képletben szereplő egyes gyógynövények hatásait a sertés hasnyálmirigy-alfa-amiláz (PPA) gátlására kísérleti amiláz-gátlási vizsgálatokkal. Az enzim sertésformája megfelelő választás ehhez a munkához, az emberi, a sertés és az egér hasnyálmirigy-alfa-amiláz közötti nagy szekvencia-hasonlóság miatt [22]. A jelen tanulmány eredményei ezért könnyen extrapolálhatók a képlet hatásmechanizmusainak megértése érdekében számos emlősön, beleértve az embereket is.

Ezen túlmenően, a molekuláris dokkoló elemzések révén megjósolják azokat a kulcsfontosságú aktív komponenseket, amelyek potenciális PPA-gátlóként működhetnek az RCM-107-ben az egyes gyógynövényekben található egyes vegyületekből, az irodalomban [20, 23–35].

2. Anyagok és módszerek

2.1. Amiláz gátlás vizsgálata

2.1.1 Anyagok.

EnzCheck® Ultra Amylase Assay Kit (E33651) és foszfátpuffer sóoldat (PBS) tablettákat (18912) a Life Technologies Australia Pty Ltd-től (Mulgrave, AUS) szereztünk be. Sertés hasnyálmirigy-alfa-amilázt (PPA) (50 mg/5 ml, 10102814001), dimetil-szulfoxidot (DMSO, 472301-500 ml) és akarbózt (A8980-1G) a Sigma-Aldrich-től (Ausztrália) vásároltunk. Az RCM-107 kapszulákat (15733, AUST L 285569) a Tong Kang Lee Kínai Orvosi Központ (Kensington VIC Ausztrália) és a Camellia sinensis/matcha/Lu cha ye növényi granulátumokat (Nong’s, HK) biztosította; Poria/Poria cocos (schw.) Farkas./Fu ling (A1601642; 1006A1601642031019); Nelumbinis folium/Nelumbo nucifera Gaertn./Ő ti (A1601450; 1356A1601450060919); Alismatis rizóma/Alisma orientalis (sam.) Juzep./Ze xie (A1600004; 1015A1600004070119); Plantaginis sperma/Plantago asiatica L./Che qian zi (A1600813; 1072A1600813080819); Cassiae sperma/Cassia obtusifolia L./Jue ming zi (A1500060; 1161A1500060040218); Sophorae flos/Sophora japonica L./Huai hua (A1601428; 1203A1601428071119) és Gardeniae fructus/Gardenia jasminoides Ellis./Zhi zi-t (A1600810; 1033A1600810050719) a GL természetes egészségügyi klinika (Strathmore, VIC, Ausztrália) szállította.

2.1.2. A minta előkészítése.

Minden RCM-107 kapszula 500 mg kivont gyógynövényport tartalmaz (beleértve 150 mg Camellia sinensis-t és 50 mg további hét összetevőt) 180 mg segédanyaggal, például vízmentes kolloid szilícium-dioxiddal, kalcium-hidrogén-foszfát-dihidráttal, magnézium-sztearáttal és mikrokristályos cellulózzal keverve. A növényi port és granulátumokat a nyersanyagok vízzel történő extrahálásával, forralással és liofilizálással nyertük. A kivont: nyers/száraz gyógynövények aránya 1:10. Húsz milligramm RCM-107 gyógynövényport és nyolc gyógynövény granulátumot lemértünk és feloldottunk 4 ml 2% DMSO-t tartalmazó desztillált vízben. A mintát 5 percig vortexeltük, és 10 percig ultrahanggal kezeltük, majd Millex-HP 0,45 μm-es szűrőn (Millipore) átszűrtük. A törzsoldat hígítását (5 mg/ml) hajtottuk végre, hogy elérjük a 300 μg/ml végkoncentrációt. Ezenkívül az RCM-107 képlet soros hígítását végeztük, így hét kalibrációs pontot kaptunk, amely 10–800 μg/ml tartományban volt. A pozitív kontroll akarbózt ugyanúgy készítettük.

2.1.3 Fluoreszcencia vizsgálat.

2.1.4. Statisztikai analízis.

A mintákat és a kontrollokat három példányban futtattuk. Az eredményeket átlag ± standard hibaként adtuk meg 3 független kísérletből. A mintákat és puffert, vagy csak enzimet és puffert tartalmazó üregeket használtunk a háttér auto-fluoreszcencia kimutatására. Az 50% -os gátlást biztosító koncentrációt (IC50) nemlineáris regresszióval számoltuk (az értékek átlag ± SD szórás), és a statisztikai szignifikanciát egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltük, amelyet Tukey többszörös összehasonlító teszt követett a Graphpad Prism segítségével. Szoftververzió 7. Eredmények P értéke 0,05). A Sophorae flos szignifikáns PPA-gátlást mutatott (P 1. ábra. Az RCM-107 képlet, nyolc egyes növényi granulátum és az akarbóz (inhibitor) szuppresszív hatása 300 μg mL -1 koncentrációban a sertés hasnyálmirigy α-amiláz aktivitására.

Az enzimaktivitás a minták vagy inhibitor hiányában 100% -os volt. Az adatokat három független kísérlet átlagából ± átlaghibájaként (SEM) fejezzük ki, minden alkalommal három ismétléssel. **** a P 0,05 értéket jelzi a PPA-n. Az alismatis rizóma enyhén növelte az enzimaktivitást, nem pedig elnyomta azt. Annak ellenére, hogy az RCM-107 formula, a Gardeniae fructus, a Nelumbinis folium és a Camellia sinensis gátló hatékonysága kevésbé aktív, mint az akarbóz, az adatok azt sugallják, hogy a PPA enyhébb inhibitoraként működhetnek. Másrészt a Poria és az Alismatis rizóma csekély mértékben vagy egyáltalán nem befolyásolta ennek az enzimnek a gátlását.

Mind az RCM-107 képlet, mind az ismert amiláz inhibitor, az akarbóz, hatásukat a PPA dózisfüggő elnyomásával mutatták ki (2. ábra). Az enzimaktivitás drámai mértékben, 85% -ról 3% -ra csökkent, amikor az RCM-107 képlet koncentrációját 10–800 μg/ml-re emeltük. Az akarbóz gátló hatását a maximális gátlás (98%) elérésével mutattuk ki 500 μg/ml koncentráció mellett. Az akarbóz alacsonyabb IC50-értéket mutatott (16,31 ± 1,74 μg/ml), mint az RCM-107 képlet (119,5 ± 17,14 μg/ml). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az RCM-107 formula képes gátolni a hasnyálmirigy α-amilázt, de nem olyan erősen, mint a pozitív kontroll.