Béldiszbiózis és „élő bélbaktériumok” kimutatása 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő japán betegek vérében

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS A bizonyítékok azt mutatják, hogy a bél mikrobiota az elhízás és a cukorbetegség fontos módosítója. Eddig azonban nincs információ a bél mikrobiotájáról és az „élő bél baktériumokról” a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő japán betegek szisztémás keringésében.

béldiszbiózis

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK Szenzitív reverz transzkripció – kvantitatív PCR (RT-qPCR) módszerrel meghatároztuk 50 féle 2 típusú cukorbetegségben szenvedő japán páciens és 50 kontroll alany bélmikrobiota összetételét, valamint annak összefüggését a különféle klinikai paraméterekkel, köztük a gyulladásos markerekkel. Elemeztük a bélbaktériumok jelenlétét a vérmintákban is.

EREDMÉNYEK A Clostridium coccoides csoport, az Atopobium cluster és a Prevotella (kötelező anaerobok) száma szignifikánsan alacsonyabb volt (P 100 NE/L) vagy súlyos vesebetegség (szérum kreatininszint> 2,0 mg/dL; 4) akut szívelégtelenség; 5) rosszindulatú daganat; 6) gyulladásos bélbetegség; és 7) az anamnézisben szereplő antibiotikumokkal végzett kezelés a vizsgálatban való részvételtől számított 3 hónapon belül. A vizsgálati protokollt a Juntendo Egyetem Humánetikai Bizottsága hagyta jóvá, és minden betegetől írásos tájékoztatáson alapuló beleegyezést kaptak a vizsgálatba való felvétel előtt.

A baktériumszám meghatározása 16S rRNS-sel célzott reverz transzkripcióval - kvantitatív PCR-rel

A vizsgálatba való felvétel után a résztvevőket friss székletminták benyújtására kérték. A székletmintákat a résztvevők vagy a kórház munkatársai közvetlenül két csőbe helyezték (~ 1,0 g/cső); az egyik cső 2 ml RNSlatert tartalmazott (RNS stabilizáló oldat; Ambion, Austin, TX), a másik pedig üres volt. A mintákat hűtőszekrénybe helyeztük 4 ° C-on (a széklet mikrobiotájának elemzéséhez), vagy fagyasztóban -20 ° C-on (a széklet szerves savkoncentrációjának és a széklet pH-jának elemzéséhez) 30 percen belül a kiválasztástól. A vérmintákat egy éjszakán át tartó böjt után, a székletminták benyújtásától számított 5 napon belül vettük. Egy milliliter vért adunk 2 ml RNAprotect bakteriális reagenshez (Qiagen, Hilden, Németország) azonnal a gyűjtés után. A mintákat -80 ° C-on tároltuk. A székletet és a vérmintákat −20 ° C-on szállították a Yakult Központi Mikrobiológiai Kutatóintézetbe.

A mintákban jelenlévő baktériumok számszerűsítéséhez a korábban leírt módszerrel (18–21) kivontuk az összes RNS-frakciót a székletből és a vérből, és a 16S rRNS-re célzott RT felhasználásával megvizsgáltuk a bél mikrobiotájának összetételét és a bélbaktériumok plazmaszintjét. –Mennyiségi PCR (qPCR) a Yakult Intestin Flora-SCAN alkalmazásával. A kivont RNS-minta három soros hígítását alkalmaztuk a baktérium rRNS-célzott RT-qPCR-hez (18–21), és a vizsgálat lineáris tartományában a küszöbérték ciklusértékeit alkalmaztuk a standard görbére, hogy megkapjuk a megfelelő baktériumsejtszámot minden nukleinsavminta. Ezeket az adatokat felhasználtuk a mintánkénti baktériumok számának meghatározásához. Az RT-qPCR vizsgálat specifitását a csoport-, nemzetség- vagy fajspecifikus primerek alkalmazásával a korábban leírtak szerint határoztuk meg (18–21). A láncindítók szekvenciáit az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel.

Szerves savak és pH mérése

A szerves savak koncentrációját a székletben és a szérumban a korábban (21) leírt módszerekkel határoztuk meg, kis módosításokkal. Röviden, a fagyasztott mintát négy térfogat 0,15 mol/l perklórsavban homogenizáltuk, és 12 órán át 4 ° C-on állni hagytuk. A szuszpenziót 20 400 x g sebességgel 4 ° C-on 10 percig centrifugáltuk. Ezután a kapott felülúszót 0,45 μm pórusméretű szűrőn vezetjük át (Millipore Japan, Tokió, Japán). A mintát szerves savakra elemeztük nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás rendszerrel (432 vezetőképesség-detektor; Waters Co., Milford, MA), és a széklet pH-ját az IQ 150 pH/hőmérővel (IQ Scientific Instruments, Inc., Carlsbad, Kalifornia).

Biokémiai vizsgálatok

Egy éjszakai böjt után vérmintákat nyertünk. A szérum lipideket (teljes koleszterin [T-CHO], HDL koleszterin [HDL-C], LDL koleszterin és triglicerid [TG]), az éhomi vércukorszintet és a HbA1c-et standard technikákkal mértük. A magas érzékenységű C-reaktív fehérje (hs-CRP), az interleukin-6 (IL-6) és a tumor nekrózis faktor (TNF) -α plazmaszintjét latex nephelometriával, kemilumineszcens enzim immunanalízissel és ELISA módszerrel mértük privát módon. laboratórium (SRL Laboratory, Tokió, Japán), ill. Az LPS-kötő fehérje (LBP) plazmaszintjét humán LBP ELISA készlettel (Hycult Biotech, Hollandia) mértük.

Az étrendi bevitel kérdőíve

Az eredeti önadagolt étrend-kérdőívet (DHQ) Sasaki és munkatársai dolgozták ki. (22) 1998-ban, és érvényességét megerősítették. A válaszadás azonban ~ 45–60 percet vesz igénybe. Ebben a tanulmányban egy rövid típusú, önadagolt DHQ-t (BDHQ) fogadtunk el (23), mert a BDHQ megválaszolása csak ~ 15–20 percet vesz igénybe. A BDHQ érvényességét szintén megerősítik a korábban leírtak szerint (23). A kérdőívet akkor töltötték ki, amikor a résztvevők meglátogatták a kórházat, hogy vérmintákat szolgáltassanak. Ez egy négyoldalas, strukturált, önállóan kitöltött kérdőív, amely az előző hónap étkezési szokásait értékelte. A legtöbb ételt és italt olyan élelmiszerek listájából választották ki, amelyeket Japánban nagyon gyakran fogyasztanak, egy olyan élelmiszerlista felhasználásával, amelyet bizonyos módosításokkal a japán Nemzeti Egészségügyi és Táplálkozási Felmérésben használtak. A BDHQ mellett a résztvevők további írásos információkat nyújtottak be a bél mikrobiotáját ismerten befolyásoló speciális élelmiszerek, például joghurt és étrend-kiegészítők fogyasztásának gyakoriságáról.

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést a JMP statisztikai szoftvercsomag 10.0.2-es verziójával (SAS Institute, Cary, NC) végeztük. Az adatokat átlagosan SD-ként fejeztük ki a normálisan elosztott adatoknál, és mediánként (interkvartilis tartomány) a ferde eloszlású adatoknál. Az adatok elemzéséhez a Mann-Whitney U tesztet használtuk. Spearman-korrelációs analízist alkalmaztunk a széklet baktériumszám/szerves savak, az LBP és a klinikai paraméterek közötti összefüggés meghatározására. A kimutatási arányt Fisher közvetlen valószínűségi teszt alkalmazásával elemeztük. P Tekintse meg ezt a táblázatot:

  • Soron belüli megtekintése
  • Felugró ablak megtekintése

A vizsgálati alanyok jellemzői

A BDHQ kérdőív szerint a becsült teljes energiafogyasztás 1662 ± 569 és 1749 ± 521 kcal/nap volt a 2-es típusú cukorbetegségben és a kontrollcsoportban. A szénhidrátbevitel és a teljes energiafogyasztás aránya a cukorbetegségben 56,1 ± 7,9% és a kontrollcsoportban 53,9 ± 6,6% volt, míg a zsírbevitel aránya 26,8 ± 5,7% és 28,6 ± 5,1%, illetve az arány a fehérjebevitel 17,1 ± 3,5% és 17,5 ± 3,0% volt. A két csoport között nem volt szignifikáns különbség az összes energia, szénhidrát, zsír és fehérje bevitelében. A két csoportban legalább heti egy alkalommal joghurtot fogyasztó résztvevők száma hasonló volt (32 résztvevő cukorbetegség; 30 kontrollcsoport).

A széklet baktériumszám nem különbözött szignifikánsan a két csoport között (2. táblázat). A kötelező anaerobák között azonban a Clostridium coccoides csoport, az Atopobium klaszter és a Prevotella száma szignifikánsan alacsonyabb volt (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

  • Soron belüli megtekintése
  • Felugró ablak megtekintése

A baktériumok számának, a szerves savak és a pH összehasonlítása a kontrollalanyok és a 2-es típusú cukorbetegek között

A metformin és az α-glükozidáz inhibitorok ismerten befolyásolják a gyomor-bélrendszert. Így megvizsgáltuk a bél mikrobiotájának különbségét a cukorbetegek között metforminnal és anélkül, valamint α-glükozidáz inhibitorokkal. Az Enterobacteriaceae szintje (7,5 ± 0,9 [n = 18] vs. 6,7 ± 1,1 log10 sejt/g [n = 31], P Tekintse meg ezt a táblázatot:

  • Soron belüli megtekintése
  • Felugró ablak megtekintése

Összefüggések a széklet baktériumszámának, a szerves savak és a különféle klinikai paraméterek között a 2-es típusú cukorbetegeknél

A 3. táblázat összefoglalja a különböző klinikai paraméterek, a BDHQ-ban felsorolt ​​élelmiszerek és a széklet szerves savak közötti összefüggéseket a 2. típusú cukorbetegeknél. A széklet összes szerves savja negatívan korrelált a telített zsírsavbevitel (r = −0,325) és a teljes zsírfogyasztással (r = −0,324), és pozitívan korrelált a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedõ betegek szénhidrátbevitelével (r = 0,281). A széklet ecetsavszintje negatívan korrelált a telített zsírsav bevitelével (r = −0,364), a teljes zsírfogyasztással (r = −0,327) és a cukorbetegség időtartamával (r = −0,301), és pozitívan korrelált a szénhidrát bevitelével (r = 0,356). Az ecetsavhoz hasonlóan a propionsav székletszintje negatívan korrelált a cukorbetegség időtartamával (r = −0,349) és a telített zsírsav bevitelével (r = −0,311). A 2-es típusú cukorbetegeknél az izovalerinsav magas székletszintje nem korrelált a BDHQ-ban felsorolt ​​klinikai paraméterekkel vagy élelmiszerekkel.

A 4. táblázat mutatja a bélbaktériumok rRNS kimutatási sebességét a vérmintákban. A baktériumokat a cukorbetegség csoportjában 50 alany közül 14-ben detektálták, míg a kontroll csoport 50 alanyából csak 2-t (28% vs. 4%, P (r = 0,313, P Tekintse meg ezt a táblázatot):

  • Soron belüli megtekintése
  • Felugró ablak megtekintése

A baktériumok száma a vérmintákban és az LBP szintje

Következtetések

A jelenlegi vizsgálat fő megállapításai a bél dysbiosis és az élő baktériumok jelenléte voltak a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő japán betegek vérében. Amar és mtsai. (17) korábban beszámolt arról, hogy a bakteriális gének vérkoncentrációja (bakteriális 16S rDNS alkalmazásával) megjósolhatja a cukorbetegség kialakulását, ami először jelzi a vér mikrobiota klinikai jelentőségét a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásában. A bakteriális 16S rDNS elemzése azonban nem képes megkülönböztetni, hogy a bélben és a vérben megcélzott baktériumok élnek-e vagy haltak-e. Ezért a jelenlegi tanulmányban RT-qPCR-t használtunk, amely képes kimutatni az élő baktériumokat mind a bélben, mind a vérben, mert ez a módszer specifikus primereket használ, amelyek a baktériumok RNS-molekuláit célozzák meg (18). Ennek a technológiának az alkalmazásával azonosítottuk a bél dysbiosis jelenlétét és a lehetséges baktériumok transzlokációját a bélből a vérbe japán, 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél.

Az összetett szénhidrátokat, például az élelmi rostokat a vastagbél mikrobiotája metabolizálja oligoszacharidokká és monoszacharidokká, és rövid láncú zsírsavakká, például vajsavvá, ecetsavvá és propionsavvá fermentálódik (2). A vajsav energiát szolgáltat a vastagbél hámsejtjeihez (27). Ezenkívül beszámoltak arról, hogy a rövid láncú zsírsavak stimulálják a GLP-1 szekréciót a G-fehérjéhez kapcsolt receptoron (FFAR2) keresztül (28). Így a bélflóra által termelt szerves savak szorosan összefüggenek az étrendből származó energiatermeléssel és az inkretin hormon általi glükóz homeosztázissal. Érdekes módon tanulmányunkban a teljes szerves sav, az ecetsav és a propionsav széklet koncentrációja a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll alanyoké, és az ecetsav és a propionsav széklet koncentrációja negatívan korrelált a a cukorbetegség időtartama. Ezenkívül a székletben lévő szerves savak elősegítik az Escherichia coli O-157 (29) eliminációját. Figyelembe véve a szerves savak ezen székletben betöltött szerepét és az eredményeinket, a szerves savak alacsony székletszintje káros lehet, ha az étkezés utáni inkretin hormon szekréciójának csökkenése és a 2-es típusú cukorbetegeknél fokozott a fertőzések iránti fogékonyság (28, 30).

A Gram-pozitív baktériumok transzlokációjának klinikai jelentősége a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedőknél továbbra sem ismert. Ebben a tekintetben fontos a lipoteichoesav (LTA) és a TLR-2 közötti kölcsönhatás a citokintermelésben. Az LTA, egy Gram-pozitív baktériumfal-komponens kötődik a TLR-2-hez (33). A legújabb tanulmányok (34,35) arról számoltak be, hogy az LTA fokozza az IL-6 expresszióját a különféle sejtekben, és tanulmányunk kimutatta a magas IL-6 szint jelenlétét 2-es típusú cukorbetegeknél. Összességében további vizsgálatokra van szükség a Gram-pozitív baktériumok transzlokációjának jelentőségének meghatározásához szisztémás gyulladásban, elhízott és 2-es típusú cukorbetegeknél.

A jelenlegi tanulmánynak vannak bizonyos korlátai. Először egy 75 g-os orális glükóz-tolerancia tesztet nem hajtottak végre kontroll alanyokban, hogy teljesen kizárják a cukorbetegség jelenlétét. Ezért a vizsgálatunkban szereplő kontrollalanyokat nem lehet biztosan nem cukorbeteg kontrollalanyoknak címkézni. Azonban az összes alany HbA1c-szintje nem haladta meg a 6,0% -ot (42 mmol/mol). Másodszor, nem tudtuk megerősíteni a bél dysbiosis és a baktériumok transzlokációja közötti okozati összefüggést, mert tanulmányunk keresztmetszetű volt. Harmadszor, mivel a 2-es típusú cukorbetegek túlsúlyosak vagy elhízottak voltak, nem zárható ki, hogy a bél dysbiosisát és a baktériumok transzlokációját az adipozitás okozta. E tekintetben a cukorbetegeket két csoportra osztottuk: az elhízott csoportra (BMI ≥25 kg/m 2) és a nem elhízott csoportra (BMI 2). A vérbaktériumok kimutatási arányában nem volt szignifikáns különbség. Ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy az elhízás nem volt a különbségek fő oka. Negyedszer, tanulmányunk kis mintamérettel rendelkezett.

Bár ezeket a korlátozásokat figyelembe kell venni, eredményeink új betekintést nyújthatnak a 2-es típusú cukorbetegség patofiziológiai mechanizmusaiba. További nagyszabású vizsgálatok szükségesek a bél és a vér mikrobiotájáról 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő japán betegeknél.

Összefoglalva, eredményeink kimutatták a bél dysbiosisát és a lehetséges vér baktériumok transzlokációját 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél. A kutatási protokoll következő lépése az, hogy intervenciós vizsgálatokat végez annak megvizsgálására, hogy a bél dysbiosisának életmódbeli beavatkozásokkal vagy probiotikumok alkalmazásával történő javulása csökkentheti-e a keringési gyulladás markerek szintjét és a baktériumok transzlokációjának sebességét a glikémiás kontroll enyhítésével.

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők köszönetet mondanak Norikatsu Yukinak, Akira Takahashinak és Yukiko Kadónak a Yakult Központi Mikrobiológiai Kutatóintézettől, akik segítettek az összegyűjtött minták elemzésében. A szerzők köszönetet mondanak Joe Matsuoka biostatisztikusnak, a Juntendo Egyetem Orvostudományi Karának Klinikai Kutatóközpontjából is, aki a statisztikai elemzéssel foglalkozott.

Szerző közreműködései. J.S. és A.K. kutatta az adatokat, részt vett az adatgyűjtésben, elemezte az adatokat, hozzájárult a vitához, valamint megírta és szerkesztette a kéziratot. F.I., T.Y., H.G., H.A., K.K., M.K., T.S., T.O., Y.T., Y.S., R.Y., T.M., Y.F. és H.F. részt vettek az adatgyűjtésben és hozzájárultak a vitához. K. N., T. T. és T. A. megtervezte a tanulmányt, elemezte az adatokat és szerkesztette a kéziratot. T.H. megtervezte a tanulmányt és hozzájárult a vitához. S.N. hozzájárult a vitához. Y.Y. megtervezte a tanulmányt, hozzájárult a vitához és szerkesztette a kéziratot. H.W. kutatta az adatokat, részt vett az adatgyűjtésben, hozzájárult a vitához és szerkesztette a kéziratot. A.K. a garancia ennek a munkának, és mint ilyen, teljes hozzáféréssel rendelkezett a vizsgálat összes adatához, és felelősséget vállal az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért.

Előzetes előadás. A tanulmány egyes részeit absztrakt formában mutatták be az American Diabetes Association 73. tudományos ülésén, Chicago, IL, 2013. június 21–25.