Két új amiloid fehérje, a RopA és a RopB a Rhizobium leguminosarum gyökércsomópontból

A Rhizobium leguminosarum mosószer-rezisztens frakciói és az azokat tartalmazó fehérjék. (A) A detergens-rezisztens frakciókat tartalmazó fehérjék funkciói és elhelyezkedése az UniProt adatai alapján (https://www.uniprot.org/). (B, C) A RopA és RopB fehérjék szerkezete az I-TASSER szerverrel jósolt [56]. A RopA és RopB másodlagos struktúrái az alábbiakban oszlopokkal vannak ábrázolva. A kék sávok a béta-lapokat, a sárga a hurkokat, a piros és a lila sávok az N-véget és a C-véget jelölik.

A RopA és a RopB morfológiailag és szerkezetileg különböző aggregátumokat alkot különböző körülmények között. (A) A RopA (felső panelek) és a RopB (alsó panelek) aggregátumok TEM képei, amelyeket különböző körülmények között nyertünk: szerves oldószerrel 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) nélkül ( bal oldali panelek) és (középső panelek) „magvakkal” és savas pH-jú 2,0 pufferrel (jobb oldali panelek). Az elektronmikroszkópos képek skálája megegyezik 1 μm-rel. (B) Rayleigh fényszóródás (RLS), (C) zavarosság, (D) fluoreszcencia anizotropia és (E) körkörös dikroizmus (CD) az amiloidoknál. (F) A másodlagos szerkezet elemeinek tartalma aggregátumokban: béta-lapok (béta), rendezetlen struktúra (unrd), fordulatok (turn) és alfa-hélixek (alfa). A panelek spektruma és oszlopszínei (B - F) a 2,0-es pH-n (sötétkék szín) vagy HFIP-t „magvetés” nélkül (kék) és a 2,0-es pH-n előállított RopB-aggregátumok (sötétvörös szín) előállított RopA adalékok jellemzőit jelölik. ) és a HFIP-t „magvetés” nélkül (narancssárga).

A RopA és RopB aggregátumok kötődnek az amiloid-specifikus tioflavin T (ThT) próbához. (A) ThT-val festett HFIP-aggregátumok felhasználásával készített konfokális mikroszkópia. Bemutatásra kerülnek a ThT-vel festett aggregátumok (bal oldali panelek) fluoreszcencia képei, átadott fény képek, amelyek az aggregátumok jelenlétét mutatják a minta vizsgált területein (középső panelek), valamint a képek átfedését (jobb panelek). A képek skála sávja 20 μm. Az amiloid fibrillákhoz kötött ThT maximális (B) abszorpcióján, (C) fluoreszcencia gerjesztésén, (D) emissziós spektrumán és (E) fluoreszcencia bomlási görbéjén egységre normalizálva. A megfelelő panelek betétjei megmutatják az abszorpció és a fluoreszcencia gerjesztés maximális értékét, a fluoreszcencia kvantumhozam és a fibrillákhoz kötött festék élettartamának értékeit. A felhasznált színek dekódolását az ábra mutatja.

Az in vitro képződött RopA és RopB fibrillumok amiloid tulajdonságai. (A) HFIP-ben vagy savas körülmények között (pH 2,0) készített, in vitro kapott RopA és RopB aggregátumok és fibrillák TEM képei. A skála értéke 200 nm. (B) HFIP-ben vagy savas körülmények között (pH 2,0) készített kongói vörös (CR) festett RopA és RopB minták polarizált fénymikroszkópiája. TL - áteresztett fény, PL - polarizált fény. A skála értéke 20 μm. (C) A Western blot segítségével detektált detergens- és proteázrezisztencia a RopA és RopB aggregátumokon és fibrillákon. Kiindulási pont - foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szolubilizált fehérjék; HFIP és pH 2,0 - fehérje aggregátumokat kaptunk a megfelelő pufferekben. U - 2% hideg SDS-vel kezelt, főzetlen minták; B - 2% SDS-sel főzve; T - tripszinnel kezelve; P - pepszinnel kezelve; P — polimerek; M — monomerek. A megfelelő molekulatömeget (kDA) feltüntetjük.

A RopA és RopB amiloid tulajdonságainak elemzése az Escherichia coli és a Saccharomyces cerevisiae sejtekben. (A - D) RopA és RopB extracelluláris szekréció az E. coli curli-függő amiloid generátor (C-DAG) rendszerében. (A) CR-t tartalmazó táptalajon lévő baktériumtelepek. (B) CR-vel festett baktériumsejtek áteresztett és (C) polarizált fényben. A skála értéke 20 μm. A Sup35NM (amiloid) és Sup35M (oldható) fehérje fragmenseket szekretáló E. coli sejteket használtuk pozitív, illetve negatív kontrollként. (D) Az E. coli célfehérjéket exportáló TEM képei. Különböző nagyítások láthatók. (E) Sárga fluoreszcens fehérjével (YFP) kondenzált RopA és RopB fehérjék aggregációjának elemzése az élesztő S. cerevisiae sejtjeiben; TL - áteresztett fény, FL - fluoreszkáló fény. Az YFP fehérjét használtuk negatív kontrollként. A skála értéke 5 μm.

A RopA és RopB amiloid tulajdonságai az R. leguminosarum sejtekben. (A, B) A RopA és RopB detergensrezisztens aggregátumképződés kimutatása R. leguminosarumban nátrium-dodecil-szulfát – poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS – PAGE) (A) és félig denaturáló detergens – agaróz gél elektroforézissel (SDD – AGE) (B). U - 2% hideg SDS-vel kezelt, főzetlen minták; A B-mintákat 2% SDS-t tartalmazó pufferben forraljuk; Az L-sejteket 10 mM luteolin, R-kontroll, rekombináns monomer fehérjék, RopA vagy RopB jelenlétében növesztettük. A megfelelő molekulatömeget (kDA) feltüntetjük. (C) Az R. leguminosarum sejtek átbocsátott fény (TL) és polarizált fény (PL) mikroszkópiája hét napig inkubálva TY lemezeken. Az R. leguminosarum sejtek TEM képe és az extracelluláris anyag, amelyet anti-RopA (D, F) vagy anti-RopB (E, G) antitestekkel jelöltünk, arany konjugált másodlagos antitestek vizualizálták. A méretarányokat képek jelzik.

Absztrakt

A RopA és a RopB morfológiailag és szerkezetileg különböző aggregátumokat alkot különböző körülmények között. (A) A RopA (felső panelek) és a RopB (alsó panelek) aggregátumok TEM képei, amelyeket különböző körülmények között nyertünk: szerves oldószerrel 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) nélkül ( bal oldali panelek) és (középső panelek) „magvakkal” és savas pH-jú 2,0 pufferrel (jobb oldali panelek). Az elektronmikroszkópos képek skálasávja 1 μm. (B) Rayleigh fényszóródás (RLS), (C) zavarosság, (D) fluoreszcencia anizotropia és (E) körkörös dikroizmus (CD) az amiloidoknál. (F) A másodlagos szerkezet elemeinek tartalma aggregátumokban: béta-lapok (béta), rendezetlen struktúra (unrd), fordulatok (turn) és alfa-hélixek (alfa). A panelek spektruma és oszlopszínei (B - F) a 2,0-es pH-n (sötétkék szín) vagy HFIP-t „magvetés” nélkül (kék) és a 2,0-es pH-n előállított RopB-aggregátumok (sötétvörös szín) előállított RopA adalékok jellemzőit jelölik. ) és a HFIP-t „magvetés” nélkül (narancssárga).

A RopA és RopB aggregátumok kötődnek az amiloid-specifikus tioflavin T (ThT) próbához. (A) ThT-val festett HFIP-aggregátumok felhasználásával készített konfokális mikroszkópia. Bemutatásra kerülnek a ThT-vel festett aggregátumok (bal oldali panelek) fluoreszcencia képei, átadott fény képek, amelyek az aggregátumok jelenlétét mutatják a minta vizsgált területein (középső panelek), valamint a képek átfedését (jobb panelek). A képek skála sávja 20 μm. Normálítva egységre a maximális (B) abszorpció, (C) fluoreszcencia gerjesztés, (D) emissziós spektrumok és (E) fluoreszcencia bomlási görbék alapján az amiloid fibrillákhoz kötött ThT-n. A megfelelő panelek betétjei megmutatják az abszorpció és a fluoreszcencia gerjesztés maximális értékét, a fluoreszcencia kvantumhozam és a fibrillákhoz kötött festék élettartamának értékeit. A felhasznált színek dekódolását az ábra mutatja.

Az in vitro képződött RopA és RopB fibrillumok amiloid tulajdonságai. (A) HFIP-ben vagy savas körülmények között (pH 2,0) készített in vitro RopA és RopB aggregátumok és fibrillák TEM képei. A skála értéke 200 nm. (B) HFIP-ben vagy savas körülmények között (pH 2,0) készített kongói vörös (CR) festett RopA és RopB minták polarizált fénymikroszkópiája. TL - áteresztett fény, PL - polarizált fény. A skála értéke 20 μm. (C) A Western blot segítségével detektált detergens- és proteázrezisztencia a RopA és RopB aggregátumokon és fibrillákon. Kiindulási pont - foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szolubilizált fehérjék; HFIP és pH 2,0 - fehérje aggregátumokat kaptunk a megfelelő pufferekben. U - 2% hideg SDS-vel kezelt, főzetlen minták; B - 2% SDS-sel főzve; T - tripszinnel kezelve; P - pepszinnel kezelve; P — polimerek; M — monomerek. A megfelelő molekulatömeget (kDA) feltüntetjük.