Diétás polifenolok, mint topoizomeráz II mérgek: B gyűrű és C gyűrű szubsztituensek határozzák meg az enzim által közvetített DNS hasítás fokozásának mechanizmusát

Absztrakt

Bevezetés

Az étkezési polifenolok (azaz a bioflavonoidok) a vegyületek változatos és összetett csoportja, amelyek különféle gyümölcsökben, zöldségekben és növényi levelekben találhatók (1-6). Úgy gondolják, hogy a bioflavonoidok fogyasztása számos egészségügyi előnyt jelent a felnőttek számára, beleértve a rák és a szív- és érrendszeri betegségek elleni védelmet (1–10). E jótékony hatások ellenére az étkezési polifenolok terhesség alatti bevitele összefüggésbe hozható olyan speciális csecsemő leukémia kialakulásával, amelyek a 11q23 (11-15) kromoszóma sávban a vegyes vonalú leukémia gén (MLL) aberrációit mutatják.

A zöld tea, amely az egyik leggyakrabban fogyasztott ital a világon, gazdag polifenolforrás (16-19). A zöld tea leggyakoribb bioflavonoidjai a katechinek, elsősorban (-) - epigallocatechin-gallát (EGCG) 1 és rokon vegyületek (16-19). Ezenkívül flavonolok és más bioflavonoidok is vannak jelen (19, 20).

Mivel az étkezési polifenolok számos sejtszintű folyamatot befolyásolnak (16, 21–26), fiziológiai hatásaik mechanikus alapja nincs pontosan meghatározva. Számos bioflavonoid azonban erős topoizomeráz II méreg (14, 27-31), és számos sejtes hatásukat legalább részben a II. Típusú enzimekkel szemben kifejtett hatásuknak tulajdonítják (14, 15, 28, 32-34.) ).

A II. Típusú topoizomerázok mindenütt jelenlévő enzimek, amelyek megváltoztatják a DNS alá- és túlszélét, és eltávolítják a csomókat és gubancokat a genomból (35–40). A gerincesek az enzim két, egymással szorosan összefüggő izoformáját, a topoizomeráz IIa-t és a β-t kódolják (37, 38, 40-45). A topoizomeráz IIα elengedhetetlen az aktívan növekvő szövetek (46–48) túléléséhez, és szükséges a megfelelő DNS-replikációhoz és a kromoszómaszegregációhoz (43, 45). A topoizomeráz IIβ sejtszinten diszpergálható, de a fejlődés során szükséges (49, 50). Fiziológiai funkciói a mai napig nem voltak pontosan meghatározva (44, 51, 52).

A genomiális integritás fenntartása érdekében a DNS-szál áthaladása során a II-es típusú topoizomerázok kovalens kötést alkotnak a hasított nukleinsav (53-55) 5'-végével. Ez a kovalens enzimmel hasított DNS köztitermék hasítási komplex néven ismert. A topoizomeráz II alapvető jellege ellenére a hasítási komplexek koncentrációját növelő körülmények állandó töréseket generálnak a genetikai anyagban (38, 40, 56-58). Ha ezek a szálak elszakadnak, elnyomják a sejtet, halál útvonalakat indukálnak (57).

Azokat a szereket, amelyek növelik a topoizomeráz II által közvetített DNS hasadást, topoizomeráz II mérgeknek nevezzük (38, 40, 59-62). Számos széles körben felírt és nagyon sikeres rákellenes gyógyszer célozza meg a II-es típusú enzimet (38, 40, 60, 63-66). Azonban a topoizomeráz II-aktív szerek társultak az MLL gént magában foglaló leukémiák kialakulásához is (58, 67-70).

A DNS-elváltozásokon (71-75) kívül a topoizomeráz II-mérgek két tág osztályba sorolhatók. Az első csoport tagjai „hagyományos”, redoxfüggetlen mechanizmus alapján járnak el. Ezek a vegyületek a fehérje-DNS határfelületen (az aktív hely tirozin közelében) kölcsönhatásba lépnek a topoizomeráz II-vel, nem kovalens módon (38, 40, 60-62). A redox-független topoizomeráz II mérgek közé tartozik az etopozid (76), valamint számos más rákellenes gyógyszer. Mivel ezeknek a vegyületeknek a topoizomeráz II-vel szembeni hatása nem függ a redox kémiaitól, a redukálószerek nem befolyásolják őket (76). Ezenkívül ezek a vegyületek hasonló szintű enzim-közvetített DNS-hasadást váltanak ki, függetlenül attól, hogy a bináris topoizomeráz II-DNS-komplexhez adják-e, vagy inkubálják-e az enzimmel a nukleinsav-szubsztrát hozzáadása előtt (76).

A második osztályba tartozó topoizomeráz II mérgek redoxfüggő módon hatnak (40, 76–82), és az enzimmel kovalens adduktokat képeznek az aktív helytől távol eső aminosavaknál (79). Ennek a csoportnak a legjellemzőbb tagjai a kinonok, például az 1,4-benzokinon és a poliklórozott bifenil (PCB) metabolitjai (76-81). Mivel ezeknek a vegyületeknek a hatása a redox-kémia függvénye, a topoizomeráz II által közvetített DNS-hasítás fokozására való képességüket visszavonják redukálószerek, például DTT jelenléte (76, 79, 83, 84). Továbbá, a redoxfüggő mérgek fokozzák a DNS hasítását, amikor az enzim-DNS komplexbe adják, de gátolják a topoizomeráz II aktivitását, ha a DNS-t megelőzően a fehérjével inkubálják (31, 76, 79, 83, 84).

Mivel sok bioflavonoid képes redox kémiai folyamatokra (beleértve a komplex oxidációs reakciókat is) (16, 21, 85-89), hatásmechanizmusuk a prioro topoizomeráz II-vel szemben nem nyilvánvaló. Például, míg a genistein (egy izoflavon) kizárólag hagyományos topoizomeráz II mérgeként működik (30), addig az EGCG (egy katechin) redoxfüggő módon mérgezi az enzimet (31).

Az étrendi polifenolok magas fogyasztása és az emberi egészségre gyakorolt hatásuk, valamint a topoizomeráz II által közvetített DNS hasítás fokozásának képessége közötti javasolt összefüggések miatt fontos megérteni azt a mechanizmust, amellyel mérgezik a II. Típusú enzimet. Ezért a jelen tanulmány a bioflavonoidok szerkezeti elemeinek meghatározására készült, amelyek a topoizomeráz II-vel szembeni hatásuk mechanisztikus alapját ellenőrzik. További cél olyan szabályok kidolgozása volt, amelyek képesek megjósolni, hogy egy adott bioflavonoid hagyományos (redox-független) vagy redox-függő topoizomeráz II mérgként működik-e.

Az eredmények határozottan arra engednek következtetni, hogy a bioflavonoidok redox-függő mérgekként való viselkedése a B-gyűrű –OH-csoportjainak sokaságától függ. Ezenkívül specifikus C-gyűrűs tulajdonságokra van szükség ahhoz, hogy ezek a vegyületek megkötjék a topoizomeráz II-t az enzim-DNS határfelületen, és hagyományos mérgekként működjenek. Ezek azonban nem befolyásolják azt a képességet, hogy redoxfüggő mérgekként működjenek.

Kísérleti eljárások

Enzimek és anyagok

A rekombináns vad típusú humán topoizomeráz IIa-t Saccharomyces cerevisiae-ben expresszáltattuk és a korábban (90-92) leírtak szerint tisztítottuk. Negatívan szupertekercselt pBR322 DNS-t állítottunk elő Escherichia coli-ból Plasmid Mega Kit (Qiagen) felhasználásával, a gyártó leírása szerint. (-) - Epigallocatechin-gallátot (EGCG), (-) - epigallocatechint (EGC), (-) - epikatechin-gallátot (EKG), (-) - epikatechint (EC), miricetint, kvercetint és kaempferolt az LKT-től vásároltak. 1,4-benzokinont és etopozidot a Sigma-tól kaptunk. Valamennyi vegyületet 20 mM törzsoldatként készítettünk 100% DMSO-ban és -20 ° C-on tároltuk.

DNS hasítás közvetíti a humán topoizomeráz IIa

A DNS hasítási reakciókat Fortune és Osheroff (93) eljárásával hajtottuk végre. A vizsgálati keverékek 220 nM humán topoizomeráz IIa-t, 5 nM negatívan szupertekercselt pBR322 DNS-t és 0-500 μM EGCG-t, EGC-t, EKG-t vagy EC-t tartalmaztak 20 μl DNS hasítási pufferben [10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA és 2,5% (v/v) glicerin]. A DNS hasítási keverékeket 6 percig inkubáltuk 37 ° C-on. Bizonyos esetekben 0–10 perces időtartamú DNS-hasítási folyamatokat figyeltünk 100 μM miricetinnel, kvercetinnel vagy kaempferollal. Az enzim-DNS hasítási köztitermékeket 2 μl 5% SDS hozzáadásával csapdába ejtettük, majd 1 μl 375 mM EDTA-t (pH 8,0) adtunk hozzá. Proteináz K-t adunk hozzá (2 μl 0,8 mg/ml oldatot), és a reakcióelegyeket 30 percig 45 ° C-on inkubáljuk a topoizomeráz II emésztése céljából. A mintákat összekevertük 2 μl 60% -os szacharózzal 10 mM Tris-HCl-ban (pH 7,9), 0,5% bróm-fenol-kékben és 0,5% xilol-cianol-FF-ben, 2 percig 45 ° C-on hevítettük, és 1% agaróz-gélben elektroforézisnek vetettük alá. 40 mM Tris-acetátban (pH 8,3) és 2 mM EDTA-ban, amely 0,5 μg/ml etidium-bromidot tartalmaz. A DNS hasítását monitoroztuk a negatívan szupertekercselt plazmid DNS lineáris molekulákká történő átalakításával. A DNS-sávokat ultraibolya fénnyel vizualizálták, és számszerűsítették őket Alpha Innotech digitális képalkotó rendszerrel.

A redukálószer hatásainak vizsgálatához a katekinek topoizomeráz IIα-val szembeni hatásait 500 μM EGCG-vel vagy EGC-vel (vagy kontrollként 25 μM 1,4-benzokinonnal vagy 50 μM etopoziddal) inkubáltuk 1 mM DTT-vel 5 percig, mielőtt azok hozzáadása a DNS hasítási reakciókhoz. Alternatív megoldásként DTT-t adtunk a reakcióelegyekhez 5 percig egy 6 perces DNS-hasítási reakció után.

A redukálószer hatásának vizsgálatához a flavonolok topoizomeráz IIa-val szemben 100 μM miricetint, kvercetint vagy kaempferolt inkubáltunk 1 mM DTT hiányában vagy jelenlétében 5 percig, mielőtt a DNS hasítási reakciókat megindítottuk volna. A reakciókat 0-20 percig figyeltük.

A flavonolok topoizomeráz IIa-ra gyakorolt hatásának vizsgálatához DNS hiányában 100 μM miricetint, kvercetint vagy kaempferolt inkubáltunk 220 nM enzimmel 0-15 percig 37 ° C-on, 15 μl DNS hasítási pufferben. A hasítást úgy indítottuk meg, hogy 5 nM negatívan szupertekercselt pBR322 DNS-t (5 μl hasítási pufferben) adtunk a reakcióelegyhez. Egyes esetekben a flavonolokat (100 μM) 1 mM DTT-vel kezeltük 5 percig, mielőtt a topoizomeráz IIa-val inkubálták volna őket.

Annak meghatározására, hogy az EC képes-e versenyezni a kvercetinnel a II-es típusú enzimért, 220 nM topoizomeráz IIa-t és 5 nM negatívan szupertekercselt pBR322 DNS-t tartalmazó DNS hasítási reakciókat hajtottunk végre 100 μM kvercetin és 0−1000 μM EC jelenlétében. A versenyt a kvercetin által kiváltott DNS-hasadás elvesztése határozta meg.

Eredmények

A zöld tea katekinek mechanizmusa, mint topoizomeráz II mérgek

A katechinek a biológiailag aktív polifenolok leggyakoribb osztálya a zöld teában (a Camellia sinensis leveleiből főzve) (16, 21). Az EGCG képviseli a fő katechint (az összes polifenol ~ 40-60% -a), majd az EGC és az EKG (~ 15-20% egyenként) és az EC (~ 5%) (23, 94) következik. Ezen vegyületek szerkezetét az 1. ábra mutatja .