Diétás terápia a neuroprotekció elősegítésére krónikus gerincvelő sérülés esetén

Langston T. Holly

1 Idegsebészeti Osztály, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA, Los Angeles, Kalifornia

Donald Blaskiewicz

1 Idegsebészeti Osztály, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA, Los Angeles, Kalifornia

Aiguo Wu

2 Integratív Biológiai és Élettani Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia

Cameron Feng

2 Integratív Biológiai és Élettani Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia

Zhe Ying

2 Integratív Biológiai és Élettani Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia

Fernando Gomez-Pinilla

1 Idegsebészeti Osztály, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA, Los Angeles, Kalifornia

2 Integratív Biológiai és Élettani Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia

Társított adatok

Absztrakt

Tárgy

A cervicalis spondyloticus myelopathia (CSM) patogenezise mind az elsődleges mechanikai, mind a másodlagos biológiai sérüléssel összefügg. A tanulmány szerzői egy új, nem invazív módszert tártak fel a myelopathiában a neuroprotekció elősegítésére azáltal, hogy kurkumin segítségével minimalizálják az oxidatív sejtkárosodást és az omega-3 zsírsavak képességét a membrán szerkezetének támogatására és a neurotranszmisszió javítására.

Mód

A CSM állatmodelljét egy, a mellkasi epidurális térben elhelyezett, nem felszívódó táguló polimer felhasználásával hoztuk létre, amely késleltetett mielopátiát váltott ki. A táguló polimer elhelyezésén átesett állatokat vagy dokozahexaénsavban és kurkuminban (DHA-Cur) gazdag étrendnek, vagy pedig standard nyugati étrendnek (WD) tették ki. 27 állaton végeztek soros járásvizsgálatot, és a gerincvelő molekuláris értékelését elvégezték a 6 hetes vizsgálati időszak után.

Eredmények

A vizsgálati időszak végén a járáselemzés szignifikánsan rosszabb funkciót mutatott ki a WD csoportban, mint a DHA-Cur csoportban. Az agyból származó neurotróf faktor (BDNF), a szintaxin-3 és a 4-hidroxinonenal (4-HNE) szintjét mértük a kompresszióval és az ágyéki megnagyobbodással érintett mellkasi régióban. Az eredmények azt mutatták, hogy a DHA-Cur csoport BDNF szintje nem különbözött szignifikánsan az ép állatokétól, de szignifikánsan magasabb volt, mint a WD csoportban. A DHA-Cur állatok szignifikánsan magasabb ágyéki megnagyobbodási szintaksin-3-ja a lipidperoxidáció (4-HNE) csökkenésével kombinálva jelezte a plazma membrán lehetséges gyógyító hatását.

Következtetések

A tanulmány adatai azt mutatták, hogy a DHA-Cur elősegítheti a gerincvelő neuroprotekcióját és semlegesítheti a myelopathia klinikai és biokémiai hatásait.

A nyaki spondylotikus myelopathia potenciálisan gyengítő rendellenesség, amelyet mind az elsődleges mechanikus, mind a másodlagos biológiai SCI okoz. Sebészeti kezelése az elmúlt évtizedekben jelentős fejlődésen ment keresztül, javítva az elsődleges mechanikai sérülés kezelésének képességét. A gerinc műszerének és az operatív technikának az előrehaladása ellenére azonban a műtét után a betegek neurológiai gyógyulása még mindig viszonylag korlátozott lehet.

Az egyik legnagyobb kihívás a CSM-ben szenvedő betegek kezelésében az a képtelenség, hogy közvetlenül kezeljük az alattomos másodlagos biológiai sérülést, amely mindenütt jelen van ezzel a rendellenességgel. Valószínű, hogy ez a gát felelős elsősorban a műtét utáni betegeknél az értelmes neurológiai gyógyulás hiányáért, valamint a nem operatív kezelésben részesülők SCI terjedéséért és a betegség előrehaladásáért. Ezért egyértelműen szükség van olyan terápiák és kezelési algoritmusok kifejlesztésére, amelyek közvetlenül kezelni a krónikus SCI-vel kapcsolatos másodlagos biológiai sérülést, amely javíthatja a nemoperatív kezelést vagy a műtéti dekompressziót követő javítási folyamatokat.

Az elmúlt években egyre nagyobb az érdeklődés az étrendi tényezőknek a központi idegrendszeren belüli specifikus molekuláris rendszerekre és mechanizmusokra gyakorolt hatása iránt. Különösen az omega-3 zsírsav-DHA mutatott terápiás potenciált a gyulladás csökkentésében és a plazmamembránok szerkezeti anyagának biztosításában kifejtett hatásai, valamint az általános idegsejtek működésére gyakorolt hatása alapján. 3 A kurkumin viszont erős gyulladáscsökkentő és antioxidáns képességgel rendelkezik 20, 23, így a DHA és a kurkumin együttes hatása potenciális stratégia lehet a CSM-ben tapasztalt biológiai sérülés ellensúlyozására.

A legtöbb figyelmet az agyra irányították, és számos tanulmány kimutatta az étrend-kiegészítés előnyeit az agy működésében, például az emlékezetben és a tanulásban, valamint a kóros folyamatok, köztük az Alzheimer-kór által okozott károk idegi helyreállításának javításában, 4 epilepszia, 8 és traumás agysérülés. 20, 23 Ezzel szemben viszonylag kevés információt tettek közzé az étrend-kiegészítők alkalmazásáról a gerincet érintő rendellenességek idegi javításának fokozására, és ez termékeny területet jelent a tanulmány számára. Jelen tanulmány célja egy új, nem invazív módszer volt a neuroprotekció elősegítésére a mielopátia állatmodelljében, DHA és kurkumin együttes alkalmazásával.

Mód

Kísérleti terv

Huszonhét 200 és 250 g közötti súlyú hím Sprague-Dawley patkányt (Charles River) ketrecenként 2–3-ot helyeztünk el, és környezettel szabályozott helyiségekben (22–24 ° C) tartottuk 12 órás fény/sötét ciklus mellett. 1 hét akklimatizálás után a patkányokat véletlenszerűen 3 csoportba soroltuk, amelyek mindegyike 9 állatot tartalmazott: gerinc összenyomás és telített zsírokkal kiegészített étrend, amelyet a nyugati társadalom étrendjének 9 megismétlésére terveztek (62% telített zsír, 34% szacharóz; D12079B, Research Diets, Inc.; WD csoport), gerinc kompresszió és diéta (102566, Dyets, Inc.) DHA-val (1,2%, Nordic Naturals, Inc.) és kurkuminnal (500 ppm, Sigma Corp .; DHA-Cur csoport) kiegészítve, és sértetlen szokásos étrenddel (kontrollcsoport). A gerincvelő kompressziós állatokon vékony epidurális, nem felszívódó polimert helyeztek el a középső mellkasi gerincben, amelynek célja késleltetett neurológiai hiány kiváltása. A műtét után a kijelölt étrendeket adták a patkányoknak, és az állatokat 6 hétig ad libitum etették. A molekuláris és funkcionális tesztelés vizsgálóit elvakítottuk a kezelőkarokhoz.

A kísérleteket az Országos Kutatási Tanács laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójának megfelelően hajtották végre. Az UCLA kancellár állatkutatási bizottsága jóváhagyta az összes eljárást.

Műtéti beavatkozások

Mágneses rezonancia képalkotási eljárás

Három állatnak műtét után 2 héttel végezték el a mellkasi gerinc MRI-t, hogy röntgenvizsgálattal megerősítsék, hogy a gerinccsatorna-kompressziót a modell indukálta (1. ábra). Magas terű, kis furatú Bruker MRI Bio-Spec 70/30 (Bruker BioSpin) 7-T mágnest használtak. 30 cm-es furattal rendelkezik Avance elektronikával, és a ParaVision 5.0 operációs szoftver vezérli. A képeket 166 mm-es BGA gradiens rendszer és 60 cm-es térfogatú adó-vevő segítségével készítettük.

Nyilas mellkasi MR-kép, amely a hátul elhelyezett szivacs (piros nyíl) okozta gerincvelő-kompressziót mutatja. A kék nyíl a gerincvelő normál kaliberű területét jelöli, amely a kompresszió területéhez képest rostralis.

Viselkedésvizsgálat

CatWalk teszt

A műtét előtt az állatok alapvonali járásvizsgálaton estek át a CatWalk automatizált járáselemző rendszer (Noldus Information Technology) segítségével. A készülék 1,3 m hosszú üveglemezből készül, homályos fénycső fényével az oldalába sugározva. Sötétített környezetben (1 lux megvilágítás alatt) a fény lefelé visszaverődik, és amikor az állat mancsa érintkezik az üvegfelülettel, a lábnyomok képeit a kamera rögzíti a sétány alatt (2. ábra). Az egyes próbák képeit digitális jelekké alakítottuk át, és 30 au (0–225 au tartomány) értékre beállított küszöbértékkel dolgoztuk fel, ami azt jelenti, hogy minden 30 au-nál fényesebb pixelt használtunk. Az ebben a vizsgálatban használt képalkotó beállítás 1 pixelt 0,085 mm-nek definiált. A patkányokat minden vizsgálat során 3 egymást követő futtatásnak vetettük alá. Az adatokat a számítógépben gyűjtöttük és a CatWalk XT szoftver segítségével elemeztük.

Felső: A DHA-Cur csoport állatának fényképe, amelyen a viselkedési teszt során járás közben a lábak az egyensúlyi gerendán vannak elhelyezve. Alsó: A WD csoportból származó állat fényképe, amely bemutatja a láb hibáját, amikor a jobb hátsó láb átcsúszik a gerenda oldalán.

Sugár-járás teszt

A sugár-járás tesztet a korábban leírt módon hajtották végre. 25 Ezt a tesztet használták az összes állat finom motoros koordinációjának értékelésére. A készülék keskeny, 10 mm széles és 180 mm hosszú fagerendából áll, és 400 mm-re van felfüggesztve az asztaltól. A patkányokat videóra vették, miközben a gerenda mindkét irányában haladtak. A lábhibákat (a gerenda oldalainak hiánya vagy megragadása) több mint 50 lépésben mindkét irányban megszámolták a gerendán.

Molekuláris értékelés

Az összes patkányt a műtét után 42 nappal eutanizálták, még az épeket is. A középső mellkasi régiót (kb. 5 mm-es cefalád és farok a gerincvelő behúzott régiójához, ahova a szivacsot helyeztük) és az ágyéki megnagyobbodási régiót boncoltuk és -70 C ° -on mentettük a fehérje elemzéséhez. A fehérjekivonatokat lízispufferben készítettük (137 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1% NP-40; 10% glicerin; 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid; 10 mg/ml aprotinin; 1 mg/ml leupeptin és 0,5 mM nátrium-vanadát). A homogenátumokat centrifugában dolgoztuk fel, és a felülúszókat összegyűjtöttük. Az összes fehérjét a MicroBCA eljárással (Pierce) számszerűsítettük.

Minden mintából 25 mikrogramm fehérjét használtunk fel a Western blot elemzéshez. A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk a következő primer antitestekkel: anti-BDNF (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-4-HNE (1: 1000), antiszintaksin-3 (1: 1000) és antiactin (1: 2000). ), amelyet belső standardként használnak. A másodlagos antitestek anti-kecske- vagy nyúlellenes immunglobulin G-torma-peroxidáz voltak (Santa Cruz Biotechnology). Pufferrel (0,1% Tween-20 TBS-ben) történő öblítés után az immunkomplexeket kemilumineszcenciával szemléltettük az Amersham ECL Plus Western blotting detektáló készlet (GE Healthcare Life Sciences) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően. A filmjeleket digitálisan szkenneltük Hewlett-Packard szkennerrel (HP Scanjet 3970), és az aktinszintre normalizált NIH Image szoftverrel számszerűsítettük.

Statisztikai analízis

Videó 1. A WD csoportba tartozó állat klipje, amely jelentős járási nehézséget mutat a gerendán átsétálva a műtét utáni 42. napon. Kattintson ide a Media Player alkalmazással való megtekintéshez. Kattintson ide a Quicktime használatával.

2. videó. A DHA-Cur csoportba tartozó állat klipje a gerendán át, lábhiba nélkül, a műtét utáni 42. időpontban. Kattintson ide a Media Player alkalmazással való megtekintéshez. Kattintson ide a Quicktime használatával.

Molekuláris értékelés

Az étrend hatása a mellkasi régióban

Oszlopdiagramok, amelyek a mellkasi régió molekuláris elemzésének eredményeit mutatják. V: A mellkasi régióban a kompresszió helyén a 4-HNE szint szignifikánsan megemelkedett a WD csoportban, mind az intakt, mind a DHA-Cur csoporthoz képest (** p. 6A. Ábra). A lumbális 4-HNE szintekben nem volt szignifikáns különbség a DHA-Cur csoport és az ép csoport között (p> 0,05). Az ágyéki szintaxin-3 szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a WD csoportban (a kontroll 67% -a), mint mindkét intakt csoportban (p 0,05; 6B. Ábra). Az ágyéki megnagyobbodás BDNF szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a WD csoportban (a kontroll 65% -a), mint mindkét intakt csoportban (p 0,05; 6C. Ábra).

Oszlopdiagramok, amelyek az ágyéki megnagyobbodás molekuláris elemzésének eredményeit mutatják. A: Az ágyéki megnagyobbodás régiójában a 4-HNE szint szignifikánsan magasabb volt a WD csoportban, mint az ép és a DHA-Cur csoportban (* p 24 az omega-3 zsírsavak közül a DHA volt az egyik leggyakrabban használt klinikailag, és számos állatmodellben alaposan tanulmányozták. A dokozahexaénsav elengedhetetlen a központi idegrendszer felépítéséhez és működéséhez, mivel a neuronális membrán foszfolipidjeinek fontos alkotóeleme. 6, 18 Ezenkívül a DHA csökkenti a gyulladást és javítja a neurotranszmissziót. 1, 6, 21

A kurkumin az indiai curry-fűszer kurkuma egyik fő összetevője, és évszázadok óta gyulladáscsökkentő és antibakteriális tulajdonságai miatt használják gyógyszeresen. A legújabb vizsgálatok antioxidáns tulajdonságokat is bemutattak, és a kurkumin központi idegrendszeri terápiás alkalmazását írták le Alzheimer-kór, subarachnoidális vérzés, 22 és iszkémiás stroke kezelésében. 14 A DHA-hoz hasonlóan a kurkumin neuroprotektív hatásait is túlnyomórészt az agyban tanulmányozták, ahol kimutatták, hogy elősegíti a neurális helyreállítást azáltal, hogy helyreállítja a szinaptikus funkció szempontjából kritikus energiaháztartást. 23

Cervicalis spondyloticus myelopathia másodlagos biológiai sérülés és a BDNF szerepe

Sérülési modellünk csökkentette a BDNF fehérje szintjét, míg a DHA-Cur étrendi kezelés ellensúlyozta ezeket a hatásokat. A neurotropinok leírt akciói a neurológiai sérülések korlátozására és az idegjavítás fokozására potenciálisan erősen alkalmazhatók a CSM kezelésében. A krónikus SCI-ben a szekunder idegsejt károsodásának egyik fő jellemzője a kritikus axonális növekedési faktorok koncentrációjának csökkenése, amely javíthatja a gerincvelő funkcionális javulását. Az idegi helyreállításban szerepet játszó kulcsfontosságú növekedési tényezők közül a BDNF különös ígéretet mutatott be, mivel bebizonyosodott, hogy fontos szerepe van az axonregenerációban, az idegsejtek túlélésének elősegítésében, a szinapszis képződésének és stabilizálásának szabályozásában, a dendritikus komplexitás növelésében és a szinaptikus hatékonyság fokozásában. 15 Az agyból származó neurotróf faktorról kimutatták, hogy rágcsálómodellben elnyomja az oligodendrocyták késleltetett apoptózisát SCI után. Apoptotikus oligodendrocita sejtvesztés következik be a CSM evolúciójában, és ennek a veszteségnek a mértéke korrelál a neurológiai sérülés súlyosságával. Még ennél is fontosabb, hogy a BDNF erőteljes hatása az idegsejtek ingerlékenységének előmozdításában döntő fontosságú az idegsejtek működésének és az információk átadásának a szinapszison keresztül.

Kasahara és mtsai. A 10. ábra fokozatosan összenyomta a patkányok gerincvezetékét egy vékony, táguló polimer lap elhelyezésével a T-7 réteg alatt. A párhuzamos kohorszoknak laminectomián mentek keresztül a polimer eltávolításával a kompresszió utáni 6., 9. és 12. héten, eutanizálták és szövettani patológiai vizsgálatnak vetették alá őket. A nonlaminectomia csoportban a BDNF fehérje szintje a kompresszió után 6 héttel megemelkedett, de 12 hét után csökkent. A dekompressziós eljárás hatékonyan megakadályozta az idegsejtek veszteségét a 6 hetes csoportban, de nem volt hatékony a 9 és 12 hetes csoportokban. A szerzők azt javasolták, hogy a BDNF expresszió kezdeti uregulációja valószínűleg kompenzációs mechanizmusként szolgált az idegkárosodás elleni védelemben, és hogy a BDNF csökkenő szintje lehet a kompresszió által kiváltott gerincvelő neuronális halál egyik mechanizmusa.

Ezeket a megállapításokat részben támogatta Xu és mtsai., 26, akik értékelték az adenovírus által közvetített BDNF (AdV-BDNF) géntranszfert a mechanikus kompresszió területén és környékén a twy/twy hiperosztotikus egér modellben. Az AdV-LacZ vagy az AdV-BDNF gerincvelőjének retrográd szállítását sternocleidomastoid injekcióval végeztük, majd 4 hét múlva a felső nyaki szegmenseket összegyűjtöttük és patohisztológiai elemzésnek vetettük alá. A BDNF iránti immunreaktivitás és a túlélő elülső szarv neuronok száma sokkal nagyobb volt az AdV-BDNF kohorszban. Úgy tűnik, hogy az általános eredmények a BDNF védőhatását sugallják, amely enyhíti a krónikus SCI hatásait.

Étrend-kiegészítő myelopathiában

Jelen tanulmányban Kasahara és mtsai által használt modellhez hasonló modellt használtunk. 10 és Kim és mtsai .; 12 egy vékony, expandálható, nem felszívódó polimert, a polivinil-alkoholt helyeztünk a laboratóriumi állatok mellkasi rétege alá, hogy késleltetett myelopathiát váltsunk ki neurológiai tünetekkel. A polimert gondosan atraumatikus módon helyeztük el annak biztosítására, hogy akut SCI ne váltódjon ki. A neurológiai hiány kialakulása elsősorban az állat mozgása során a szűkített szegmensen átívelő szakaszsérüléssel függött össze, hasonlóan az emberi CSM-ben előforduló dinamikus myelopathia etiológiájához. 5.

A kurkumin és a DHA alkalmazásának ésszerűsége a myelopathia másodlagos biológiai sérülésének leküzdésére többszörös. Korábban kimutattuk, hogy a kurkumin-származékkal végzett étrendi kezelés a gerincvelő BDNF-szintjének emelkedését eredményezte a kiegészítést nem kapó állatok szintjéhez viszonyítva. 25 Ezenkívül in vitro vagy in vivo vizsgálatok azt mutatták, hogy a DHA elősegíti a központi idegrendszeri neuronok növekedését a BDNF működésének bevonásával. 24 Tehát a jelen tanulmányban az idegjavítás egyik feltételezett mechanizmusa az volt, hogy a kurkumint és a DHA-t a BDNF szintjének fenntartására a sérült gerincvelőben és annak hatásainak megerősítésére használták.

A sejtmembrán sérülését tovább elemeztük a szintaktin-3 szint mérésével az ágyéki megnagyobbodás régiójában. Ez a fehérje a preszinaptikus plazmamembránra lokalizálódik, amely döntő szerepet játszik a vezikulák dokkolásában és fúziójában a neurotranszmitter újbóli lerakódása során. 16 Tekintettel arra, hogy a szintaxin-3 kimutathatóan a DHA 2 hatása alatt áll, és szinaptikus érintkezési területeken helyezkedik el, ez megfelelő jelző étrendi kezelésünk plazmamembránra gyakorolt hatásainak felmérésére. Ennek megfelelően adataink szignifikánsan magasabb ágyéki szintaxin-3-ot mutattak a DHA-Cur csoportban, és a lipidperoxidáció (4-HNE) csökkenésével együtt jelezték a plazma membrán lehetséges gyógyító hatását.

A DHA-Cur-t kapó állatok szignifikánsan magasabb szinten tartották a gerincvelő BDNF szintjét mind a kompresszió szintjén, mind az ágyéki megnagyobbodás régiójában, mint azok, amelyek nem kaptak étrend-kiegészítést. A fent említett állat-CSM vizsgálatok és a BDNF egyéb laboratóriumi vizsgálatai alapján valószínű, hogy a gerincvelő BDNF fenntartott szintje, csökkent sejtmembrán sérüléssel együtt, kritikus tényezők voltak a DHA-Cur csoportban megfigyelt megőrzött neurológiai funkcióban.

Következtetések

Nagy szükség van az idegi helyreállítási stratégiák kidolgozására, amelyek segítenek semlegesíteni a CSM-ben szenvedő betegek nem operatív és operatív kezelése során felmerülő másodlagos biológiai sérüléseket. Az étrend-kiegészítés a központi idegrendszer egészében sikeresnek bizonyult különféle kóros állapotok kezelésében. A mielopátia állatmodelljében bebizonyítottuk, hogy a DHA és a kurkumin számos molekuláris mechanizmus révén képes ellensúlyozni a krónikus gerincvelő-kompresszió hatásait, ami megőrzi a neurológiai funkciókat.