Ecdysteroidok: Az anabolikus szerek új osztálya?

MK Parr

1 Gyógyszerészeti és Gyógyszerkémiai Intézet, Biológiai Tanszék, Kémia, Gyógyszerészet, Freie Universität Berlin, Németország

F Botrè

2 Laboratorio Antidoping, Federazione Medico Sportiva Italiana, Róma, Olaszország

A Naß

1 Gyógyszerészeti és Gyógyszerkémiai Intézet, Biológiai Tanszék, Kémia, Gyógyszerészet, Freie Universität Berlin, Németország

J Hengevoss

3 Celluláris és Molekuláris Sportorvosi Osztály, Kardiovaszkuláris Kutatási és Sportorvosi Intézet, Német Kölni Sportegyetem, Németország

P Diel

3 Celluláris és Molekuláris Sportorvosi Osztály, Kardiovaszkuláris Kutatási és Sportorvosi Intézet, Német Kölni Sportegyetem, Németország

G Wolber

1 Gyógyszerészeti és Gyógyszerkémiai Intézet, Biológiai Tanszék, Kémia, Gyógyszerészet, Freie Universität Berlin, Németország

Absztrakt

Az ecdysteroidokat tartalmazó étrend-kiegészítők egyre nagyobb számát „természetes anabolikus szerként” forgalmazzák. A legújabb vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy anabolikus hatásukat az ösztrogénreceptor (ER) kötődése közvetíti. Ebben a tanulmányban az ecdysterone anabolikus hatását összehasonlították a jól jellemzett anabolikus anyagokkal. Biológiai kiértékelésként patkányok egyetlen lábizomának rostméretére gyakorolt hatásokat, valamint a C2C12-ből származó miotubusok átmérőjét használtuk. Az ecdysterone erőteljes hipertrófiás hatást fejtett ki a patkány nyelvének izomszálméretében, amely még erősebbnek bizonyult a metandienon (dianabol), az ösztradién-dion (trenbolox) és a SARM S 1 vizsgálati vegyületekhez viszonyítva, mindegyiket ugyanabban az adagban (5 mg/kg) adták be. testtömeg, 21 napig). A C2C12-ben a myocsőben az ecdysterone (1 µM) a dihidrotesztoszteronnal (1 µM) és az IGF 1-vel (1,3 nM) összehasonlítható átmérő jelentős növekedését váltotta ki. A molekuláris dokkolási kísérletek támogatták az ecdysterone ERβ által közvetített hatását. A sportban betöltött státusának tisztázása érdekében úgy kell tekinteni, hogy az ecdysterone a Doppingellenes Világügynökség tiltott anyagok listájának „S1.2 egyéb anabolikus szerek” osztályába tartozik.

BEVEZETÉS

Az ecdysteroidokat széles körben forgalmazzák a sportolók számára étrend-kiegészítőként, amelyek hirdetik az erő és az izomtömeg növelését az ellenállóképzés során, a fáradtság csökkentése és a gyógyulás megkönnyítése érdekében. Számos tanulmány számolt be az ecdysteroidok farmakológiai hatásainak széles skálájáról emlősökben, amelyek többsége hasznos a szervezet számára. Az 1980-as években a legaktívabb fitoecdysteroidot, az ecdysteront (béta-ecdizont, „orosz titok”) feltételezték, hogy orosz olimpiai sportolók használják. Az ecdysteroidok szintje a nyugati étrendben általában alacsony (általában kevesebb, mint 1 mg/nap –1 –1), míg a testépítők által alkalmazott dózisokat legfeljebb 1000 mg/nap –1 .

Az ecdysterone különféle állatfajokban (patkányok, egerek, japán fürj és szarvasmarhák) és emberekben végzett lehetséges növekedést elősegítő hatásainak átfogó vizsgálata [1–13] számolt be, és azóta rengeteg pletyka kering a sportolók általi visszaélésről. Kimutatták, hogy az ecdysterone fokozza a vázizomzat fehérjeszintézisét [14]. Gorelick és mtsai. javasolt fokozott fehérjeszintézis mechanizmusa a PI3K/Akt jelátviteli út közvetlen vagy közvetett stimulálása [9, 15].

Fordítva az anabolikus-androgén szteroidokkal (AAS), amelyek elsősorban az androgén receptorhoz (AR) való kötődés révén növelik az izomtömeget, emlősökben eddig még nem írtak le olyan rovarokban található sejteket, amelyek homológok lennének a rovarokban található ecdysone nukleáris receptorral [9]. . Csak nemrégiben mutatható ki sejttenyésztési kísérletekben az ecdysterone kötődése a humán ERβ-hoz (ED50 = 13 nM), és a C2C12 sejtekben a hipertrófia indukcióját az ERβ aktiváció közvetítette [2]. A tanulmány célja az ecdysterone anabolikus hatékonyságának tisztázása volt, összehasonlítva más ismert anabolikus szerekkel, és az ERβ által közvetített hatás hipotézisének támogatása in-silico modellezéssel.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

In-Vitro hipertrófia modell

Az ecdysterone anabolikus tulajdonságait C2C12-ből származó myotube-ok inkubálásával teszteltük a tesztvegyületekkel és csoportonként 47 myocső átmérőjének meghatározásával (a myotube mentén 10–20 µm-enként mért átlagok), az előzőekben leírtak szerint [2]. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott koncentrációk 1 µM ecdysterone és dihidrotesztoszteron esetében (kémiai szerkezetek az 1. ábrán) és 1,3 nM az IGF-1 növekedési faktor esetében.

Az ecdysterone (A), valamint az összehasonlításhoz használt egyéb anabolikus szerek kémiai szerkezete (B: szelektív androgén receptor modulátor (SARM) S-1, C: anabolikus androgén szteroid (AAS) metandienone, D: AAS dihidrotesztoszteron, E: AAS ösztradién-dion)

Állattanulmány

A hím Wistar patkányokat (n = 42, Janvier, Le-Genest St-Isle, Franciaország) véletlenszerűen allokáltuk verum és kontroll csoportokhoz. Az állatokat ellenőrzött körülmények között tartottuk (T = 20 ± 1 ° C, relatív páratartalom Φ = 50–80%, 12 órás világos/12 órás sötét), szabad hozzáféréssel a szokásos étrendhez (SSniff GmbH, Soest, Németország) és víz. A sportolók helyzetének utánzása érdekében az ép (azaz nem kasztrált) állatokat naponta egyszer 5 mg/kg -1 testtömeg-rel kezelték 21 napon keresztül. A Verum csoportok ecdysterone, metandienone, ösztradién-dion vagy S-1 injekciókat kaptak, mindegyiket 20% DMSO és 80% mogyoróolaj oldatában hígítva. A kontroll csoportokat csak vivőanyaggal injektálták. Az állatokat az elfogadott állatorvosi orvosi gyakorlatnak megfelelően és az Állatvédelmi Bizottság jóváhagyásával kezelték. További kísérleti részleteket a korábban leírtak szerint hajtottunk végre [2].

Az ecdysterone anabolikus hatékonyságát a hím Wistar patkányok egyedüli izomzatának izomrostméretében határoztuk meg. A hatást hasonlítottuk össze a metandienon (dianabol) és az ösztradiéndion (trenbolox) anabolikus androgén szteroidokkal, valamint az S-1 szelektív androgén receptor modulátorral (kémiai szerkezetek az 1. ábrán).

A szteroidreceptor-kötés in-silico modellezése

Molekuláris modellezési kísérleteket hajtottak végre annak alátámasztására, hogy az ecdysterone anabolikus hatását az ERβ-kötődés közvetíti, nem pedig AR, mint a klasszikus anabolikus androgén szteroidok esetében ismert. Így az ecdysterone dokkolt a két altípus ERα és ERβ kristálystruktúrákba, valamint az AR-ba (PDU 3UUD [16] ERα, 3OLL [17] ERβ és 2AM9 AR [18] esetében. Ezek a kristályszerkezetek komplexeket képviselnek az ösztradiollal az ER és a tesztoszteronnal az AR számára, hogy megbizonyosodjanak arról, hogy az agonizmus szempontjából releváns fehérje konformációt képviselik. A dokkolási kísérletet a GOLD [19] szoftver segítségével hajtották végre, lehetővé téve az oldallánc rugalmasságát a kötési régiókban, lehetővé téve az adaptációt a lényegesen nagyobb ligandum ecdysterone-hoz. A kötő pózokat a legfontosabb interakciós jellemzők elemzésére a LigandScout 3D farmakofor modellező platform segítségével [20, 21] használtuk.

Statisztika

A statisztikai adatok kiértékelését Kruskal – Wallis teszttel végeztük, majd páronként összehasonlítottuk a Mann – Whitney U-teszttel. A 2. és 3. ábrán látható doboz- és pofaszakasz ábrák az eloszlás minimális, 25., 50. (medián), 75. percentilis és maximális értékét képviselik. A szignifikancia szintet p ≤ 0,05-nél állapítottuk meg.

A DHT (10-6 M), az IGF-1 (10 ng · mL -1) és az ecdysterone (Ecdy, 10-6 M) hatása a C2C12 myocső átmérőjére. Csoportonként 47 myocső átmérőjének meghatározása.

Nincs szignifikáns különbség a kezelési csoportokon belül, * szignifikáns a kontrollhoz képest, p ≤ 0,05 Kruskal – Wallis H-teszt és Mann – Whitney U-teszt alapján

Az ecdysterone (Ecdy) anabolikus hatása az egyetlen izom rostméretében kifejezve ép patkányokban.

Az egyedüli izom rostméretének szignifikánsan nagyobb növekedése Ecdy után az ösztradién-dionhoz (EDD), a metandienonhoz (MD) és a SARM S 1-hez (S1) képest, * szignifikáns a kontrollhoz képest, + szignifikáns az Ecdy-vel szemben, p ≤ 0,05 Kruskal – Wallis H-teszttel és Mann – Whitney U-teszt

EREDMÉNYEK

Anabolikus tulajdonságok meghatározása

C2C12 eredetű myocsőt használtunk in vitro modellként az anabolikus aktivitások tesztelésére. Az ecdysteronnal végzett inkubálás szignifikánsan megnövekedett myotube átmérőket mutatott a vivőanyaggal kezelt kontroll sejtekhez képest (2. ábra). Összehasonlítva a hatást az endogén anabolikus androgén szteroid-dihidrotesztoszteronnal azonos koncentrációban és az IGF-1 anabolikus növekedési faktorral (az összehasonlításhoz szükséges koncentráció 1,3 nM), valamivel magasabb (statisztikailag nem szignifikáns) hatást figyeltünk meg.

A sportolók helyzetének utánzása érdekében az ép hím Wistar patkányokat 21 napig kezeltük a tesztkomponensekkel. Az egyedüli izom jelentősen megnövekedett rostméretét meghatároztuk az ecdysterone-kezelés után. Összehasonlítás az anabolikus androgén szteroidokkal, metandienonnal vagy ösztradién-dionnal kezelt állatokkal, és a SARM S-1 szignifikánsan nagyobb hatást eredményezett az ecdysteronnal kezelt állatokban azonos dózisok alkalmazásakor (3. ábra).

A szteroidreceptor-kötés vizsgálata in-silico

A javasolt ERβ által közvetített anabolikus mechanizmus megalapozottságának hangsúlyozása érdekében ecdysterone molekuláris dokkolási kísérleteket végeztek az emberi nemi szteroid receptorokba, hogy mechanisztikus betekintést nyerjenek az ecdysterone kötődésébe.

Az AR/tesztoszteron komplex röntgenszerkezetéhez viszonyítva az ecdysterone in-silico molekuláris dokkolása az AR-ban kedvezőtlen kötődési pózot és teljesen eltérő háromdimenziós orientációt mutatott ki az AR/ecdysterone komplexben: azokon a helyeken, ahol a metilcsoportok vannak a tesztoszteron endogén ligandumára talált hidroxilcsoportok szterikusan interferálnak a receptorral ecdysterone esetén. Ezenkívül a tesztoszteron komplexben fontos kölcsönhatást közvetítő vízmolekulát az ecdysterone dokkoló póz metilcsoportja helyettesíti, ami kedvezőtlen interakciós mintát eredményez.

Ezzel szemben mindkét ER izoform egy kötő oldalformát kínál, amely alkalmasabb az ecdysterone befogadására. A dokkoló pózok mindkét altípusban több, a 4. ábrán látható kölcsönhatásban részesülnek. Három további hidrogénkötés képződik kizárólag az ecdysterone dokkoló pózjában az ERβ-ban, ami megmagyarázhatja a kísérletileg megfigyelt izoformapreferenciát [2, 22]: Az ERβ-ban a ligandum képes a Met343-hoz elég közel konformációt adaptálni és hidrogénkötést képezni a hidroxilcsoporttal. csoport az ecdysterone 2. pozíciójában. Ezenkívül további két hidrogénkötés figyelhető meg a terminális hidroxilcsoporttal a β-altípus gerincéhez (Leu346, Phe404, illetve Leu387).

ERα (PDB 3UUD [16], felül) és ERβ (PDB 3OLL [17], alul) szilíciumdokkolós dokkolt ecdysteronnal.

Az ERβ további hidrogénkötéseket képez a Met343-mal az ecdysterone hidroxilcsoportjával és a fehérje gerincével a terminális alkihidroxilcsoporthoz. A nyilak hidrogénkötéseket jeleznek (zöld: donor, piros: akceptor), míg a sárga gömbök hidrofób kölcsönhatásokat mutatnak. A maradék számozását a felhasznált PDB bejegyzéseknek megfelelően választottuk meg.

VITA

Az itt közölt adatok azt mutatják, hogy az ecdysterone az izmok hipertrófiáját idézi elő, összehasonlítható vagy még nagyobb hatékonysággal, amint azt az anabolikus androgén szteroidok, a SARM-ek vagy az IGF-1 mutatják. Hasonló eredményeket jelentettek Syrov és munkatársai is. [14]. Beszámoltak a testtömeg-növekedés és a súly növekedéséről, valamint a tibialis izom megnövekedett fehérjetartalmáról patkányokban ecdysterone beadása után (5 mg · kg –1 BW, orálisan, 10 napig).

A generált dokkolási pózok alátámasztják azt a hipotézist, hogy az ecdysterone nem mutat szignifikáns kötődést az AR-nál, hanem az ER-hez, előnyben részesítve az ERβ altípust.

KÖVETKEZTETÉSEK

Vizsgálatunk egyértelműen megerősítette az ecdysterone anabolikus aktivitását. Az ecdysterone anabolikus hatékonysága összehasonlítható vagy annál magasabb volt, mint az anabolikus androgén szteroidok, SARM-ek vagy IGF-1 esetében. Ezenkívül a szilíciumon belüli dokkolási kísérletek támogatják az ecdysterone feltételezett nem androgén mechanizmusát. Valószínűbb, és a kísérleti adatokkal egyetértésben az ecdysterone anabolikus aktivitása az ER-hez, különösen az ER-bétához való kötődés útján történik. A doppingmegelőzés tekintetében az ecdysterone magas anabolikus hatékonysága indokolja anabolikus szerként való besorolását, ezért fel kell venni a Doppingellenes Világügynökség tiltott anyagainak listáján az „S1 anabolikus szerek” kategóriába.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentettek összeférhetetlenséget a kézirat közzététele kapcsán.