Egér kis interferáló RNS-ek expressziója salátában mesterséges mikroRNS technológiával

Kertészeti és természeti erőforrások tanszék, Kansas Állami Egyetem, Manhattan, KS 66506, USA

Molekuláris és humángenetikai Tanszék, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030, USA

Boyce Thompson Intézet, Cornell Egyetem, Ithaca, NY 14853, USA

Agrárkutatási Szolgálat, az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma; Baylor College of Medicine Gyermekgyógyászati Osztály, Gyermektáplálkozási Kutatóközpont, Houston, TX 77030, USA

* A levelezés szerzője:

** A levelezés szerzője:

Kertészeti és természeti erőforrások tanszék, Kansas Állami Egyetem, Manhattan, KS 66506, USA

Absztrakt

A mesterséges miRNS technológia lehetővé teszi a siRNS-ek előállítását a megcélzott gének expressziójának szabályozására. Az siRNS-ek alkalmazása a génexpresszió megváltoztatására instabilitásuk miatt kihívást jelent, és eszközt igényel az siRNS-ek hatékony bejuttatására a gazdaszervezetbe. Itt arról számolunk be, hogy az állati mRNS-ekre irányuló siRNS-ek heterológ módon expresszálhatók és stabilan termelhetők a salátában. Módosítottuk a rizs miRNS prekurzorait, hogy siRNS-eket állítsunk elő salátában, és ezáltal potenciálisan megcélozhassuk az egér 3. komplementjének mRNS-eit (C3) és a 7. alvadási faktor (CF7). Az elsődleges és az érett siRNS expresszióját a transzgenikus fejes saláta vonalakban Sanger szekvenálással igazoltuk. Vizsgálatunk bemutatja a gén expressziójának megváltoztatására alkalmas eszközt a megcélzott gazdaszervezetben, és potenciálisan hasznos lehet az siRNS-alapú orális terápiában.

MÓDSZER ÖSSZEFOGLALÓ

A rizs miRNS gerincét, az Osa-MIR528-at testre szabtuk, hogy az egér messenger RNS-eket célzó amiRNS-eket tartalmazó növényi expressziós vektorokat állítsunk össze. Ezt a rendszert, amelyet korábban monocotokban használtak az amiRNS expressziójára, ma már mezőgazdasági szempontból fontos dikotákban, például salátában, amiRNS-ek előállítására használják, lehetővé téve a különféle, orvosilag fontos fehérjékre irányuló siRNS-ek előállítását, amelyek potenciálisan az étrenden keresztül szállíthatók.

Ezeknek a tanulmányoknak a genezise az volt a vágy, hogy pontos eszközöket nyújtsanak a genetikai anyag étrendi fogyasztása és a génexpresszió változásai közötti kapcsolat vizsgálatához. Ez a munka megállapítja az egér máj génjeit megcélzó siRNS-eket expresszáló növényi eredetű élelmiszerek fontosságát. A máj gén expressziójában bekövetkező bármilyen változás számszerűsíthető egyszerű, megalapozott vizsgálatokkal, amelyek figyelemmel kísérik a funkcionális fehérjék expresszióját. Az itt megtervezett transzgénikus saláta vonalak terítették a táblázatot a jövőbeni étrendi vizsgálatokhoz. Az emlős komplement faktorok által szabályozott véralvadás, beleértve a májban a 3. komplementet (C3) és a 7. koagulációs faktort (CF7), létfontosságú folyamat az erek sérülése által okozott vérzés megállítására [11]. Kimutatták azonban, hogy a túlzott C3 és CF7 termelés vérrögöket is okoz, amelyek jelentős egészségügyi kockázatokat jelenthetnek és halálhoz vezethetnek a szív- és érrendszer nem megfelelő működése miatt [12,13].

Ebben a tanulmányban salátát alkalmaztak étrendi amiRNS-ek megcélzásához C3 és CF7 messenger RNS-ek. Az endogén rizs miRNS gerincét, az osa-MIR528 245 bázispár hosszúságú fragmensét [14, 15] testre szabták az egér C3 és CF7 fehérjéit megcélzó amiRNS-ek tervezésére. A C3 és CF7 amiRNS-szekvenciákat manuálisan terveztük az egérgenom-szekvenciák annotációjával, és az osa-MIR528 21 bp-jét PCR-rel C3 és CF7 amiRNS-szekvenciákkal helyettesítettük (1A. Ábra).

1.ábra. Az amiRNS-eket tartalmazó növényi expressziós vektorok, amelyek célja az egér C3 és CF7 messenger RNS-einek megcélzása, az osa-MIR528 245 bp-os fragmensének felhasználásával.

(A) A szárhurok-szekvenciából származó 21 bp méretű osa-MIR528 (fekete betűk) helyébe C3 (felső panel) és CF7 (alsó panel) szekvenciák (piros betűk) léptek, hogy siRNS-eket hozzanak létre. A felhasznált klónozási helyek voltak XbaI és SacI amelyek restrikciós emésztés után körülbelül 259 bázispár méretű fragmenst helyeznek be. (B) A bináris vektorok T-DNS régiójának térképe (felső panel, pC3amiRNS; alsó panel, pCF7amiRNS) az átalakításhoz használt.

LB: Bal határ; NPTII: neomicin-foszfotranszferáz; p35S: karfiol mozaik vírus 35S promoter; pNos: Nopalin-szintáz-promoter; RB: Jobb határ; tnos: Nopalin szintáz terminátor.

Három független C3-at generáltunk (C3siRNS-1, -2 és -3) és CF7 (CF7siRNS-1, -2 és -3) transzgénikus vonalakat, amelyek önbeporzóztak, és az utódvonalakat genotipizáltuk a T-DNS jelenlétére (2A. ábra). Az amiRNS szekvenciákat tartalmazó vektor 245 bázispárját használtuk méretszabályozó markerként az amiRNS szekvenciák genomi DNS-be történő beillesztésének megerősítésére. Az összes transzgénikus vonal DNS-je a marker méretének megfelelő 245 bp sávot mutatott. A kontroll növényeknél nem detektáltunk PCR terméket (2B. Ábra). A 3 hónapos C3- és CF7-expresszáló saláta növények összehasonlíthatók voltak a vad típusú növényekkel, valamint a fenotípus és a hozam C3- és CF7-expresszáló saláta növények nem voltak megkülönböztethetőek a normál növekedési körülmények között termesztett vad típusú növényektől (2C. ábra). Kifejezés kifejezése C3 és CF7 a jelek szerint nincs káros hatása a teljes növényi morfológiára.

2. ábra. A molekuláris és fenotípus elemzése C3siRNS- és CF7siRNS-salátákat kifejezve.

(A) A PCR kimutatása NPTII gén a transzformált saláta növények genomiális szintjén. (B) C3 és CF7 mesterséges mikroRNS-inszertek PCR-kimutatása saláta genomi DNS-be. Pozitív kontroll, mesterséges mikroRNS-ek; negatív kontroll, vad típusú saláta. Az alapozó szekvenciákat az 1. táblázat mutatja. (C) A fenotípusok C3siRNS-kifejezve, CF7siRNS-expresszáló és WT saláta növények.

NPTII: Neomicin-foszfotranszferáz II gén; WT: Vad típusú.

A transzgén kópiaszámának transzformált növényekben történő meghatározásához abszolút mennyiségi meghatározást valós idejű kvantitatív PCR alkalmazásával végeztünk. Az egyes minták összes reakciótérfogata 10 μl volt, a minták 60 ng genomi DNS-t, 30 pmol előre- és reverz primereket és 7,3 μl iQ ™ SYBR® Green Supermix-et (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) tartalmaztak. Az előre- és a reverz primereket úgy terveztük meg, hogy amplifikálják az osa-MI-528 gerincet a T-DNS régióban (1. táblázat). A következő hőciklust hajtottuk végre CFX96 Bio-Rad hőciklerrel: 94 ° C 10 percig, majd 34 ciklus 95 ° C 30 másodpercig, 58 ° C 20 másodpercig és 72 ° C 30 másodpercig. Két technikai replikációt használtak. A genomi DNS ötszörös hígításának sorozatát ábrázoltuk a ciklusküszöb (Ct) értékekkel szemben, hogy standard görbét kapjunk (2A. Kiegészítő ábra). A minták Ct értékeit, valamint a standard görbe meredekségét és metszetét használtuk a transzgén kópiaszám kiszámításához: Ct (minták) = meredekség (standard görbe) × log (másolat száma) + metszet (standard görbe) [20 ]. A transzgén kópiaszám-elemzés szintén megerősítette két-hat T-DNS kópia sikeres integrációját a transzgénikus saláta vonalak genomjában (2B. Kiegészítő ábra).

Asztal 1. Alapozó szekvenciák.KísérletForward primerReverse primer

NptII PCR	5′-gaggctattcggctatgactg-3 ′	5′-atcgggagcggcgataccgta-3 ′
Elsődleges amiRNS PCR és qPCR példányszám	5′-cagcagcagccacagcaaaat-3 ′	5′-atggcatcagcatcagcagc-3 ′
Elsődleges amiRNS szemikvantitatív RT-PCR	5′-cagcagcagccacagcaaaat-3 ′	5′-atggcatcagcatcagcagc-3 ′
Kvantitatív valós idejű PCR belső kontroll (tonoplaszt belső fehérje 41)	5′-gagagatttgctggagggaaacta-3 ′	5′-cctttgactgatgatgtttgga-3 ′
Érett amiRNS végpont PCR és kvantitatív valós idejű PCR
- 3. kiegészítés	5′-ctcagcccactgtgcaagac-3 ′	5′-ccagtgcagggtccgaggta-3 ′
- 7. alvadási faktor	5′-cacgccgggatcatctcaa-3 ′	5′-ccagtgcagggtccgaggta-3 ′
Szár-hurok reverz transzkriptáz
- 3. kiegészítés	5′-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctttag-3 ′
- 7. alvadási faktor	5′-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacgtaa-3 ′

A PCR-rel megerősített transzgénikus növényeket tovább szemikvantitatív RT-PCR-nek vetettük alá annak ellenőrzésére, hogy az integrált T-DNS sikeresen átíródott-e a salátában. A teljes RNS-t TRIzol ™ reagenssel (Thermo Fisher Scientific) izoláltuk, majd RNS-mentes DNS-I-gyel kezeltük a genomiális DNS-szennyeződés kiküszöbölése érdekében. Egy mikrogramm RNS-t használtunk az Oligo (dT) Primer (Bioline, London, Egyesült Királyság) segítségével szintetizált cDNS-hez a készlet gyártójának utasításait követve (RevertAid First Strand cDNS szintézis készlet, Thermo Fisher Scientific). A szemikvantitatív RT-PCR-t egy speciális primerkészlet alkalmazásával hajtottuk végre, amely az expressziós kazettából származó primer amiRNS-szekvenciákat tartalmazó 245 bp-ot amplifikálta. A célhőmérséklet detektálására a következő hőciklusos programot alkalmaztuk: 94 ° C 5 percig, majd 35 ciklus 94 ° C 1 percig, 59 ° C 45 másodpercig, 72 ° C 1 percig és 72 ° C 10 percig. A szemikvantitatív RT-PCR 245 bp sávot mutatott, amely megfelel a primer amiRNS-ek várható méretének. A kontroll növényekben nem detektáltunk PCR terméket (3A. Ábra).

3. ábra. Az elsődleges és érett amiRNS-ek PCR-detektálása és az érett C3 és CF7 amiRNS-ek szekvencia-szekvenciája szár-hurok univerzális reverz primer alkalmazásával.

(A) A primer C3 és CF7 amiRNS-ek RT-PCR kimutatása C3siRNS- és CF7siRNS-salátákat kifejezve. Negatív kontroll, vad típusú saláta. (B) Szár-hurok végpont PCR kimutatása érett C3 és CF7 amiRNS-ekből C3siRNS- és CF7siRNS-salátákat kifejezve. Negatív kontroll, vad típusú saláta. Az alapozó szekvenciákat az 1. táblázat mutatja. (C) Az érett C3 amiRNS várható és kapott szekvenciái. (D) Az érett CF7 amiRNS várható és kapott szekvenciái.

Tanulmányunkban generáltunk C3- és CF7-kifejezve saláta növényeket. Az elsődleges és az érett amiRNS-ek expresszióját a transzgénikus salátában szemikvantitatív RT-PCR-rel, illetve végpont-PCR-rel igazoltuk, és szekvenálással tovább megerősítettük. Az állati siRNS-ek stabil előállítása ehető, nagy biomasszával rendelkező leveles növényekben, és étrendi siRNS-ként történő szállításuk nagy potenciállal rendelkezik az instabil meztelen siRNS-alkalmazások korlátozásainak leküzdésére.

Szerzői hozzájárulások

S Park és KD Hirschi tervezte a kísérleteket. T Kakeshpour, TM Tamang, WD Park, M Manohar és J Yang végezték a kísérleteket. T Kakeshpour, TM Tamang és S Park elemezte az adatokat. Minden szerző hozzájárult a kézirat megírásához.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük a JK Parknak a saláta átalakításával kapcsolatos kiváló technikai segítséget.

Pénzügyi és versengő érdekek nyilvánosságra hozatala

Ezt a projektet a Mezőgazdasági és Élelmiszer-kutatási Kezdeményezés 2016-67017-24712 számú pályázati támogatása finanszírozta az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának (USDA) Nemzeti Élelmezési és Mezőgazdasági Intézetének (S Park), a National Science Foundation IOS-1741090 számú támogatásának (S Park)., valamint az USDA Agrárkutatási Szolgálat az 58-3092-5-001 számú kooperatív megállapodás alapján (KD Hirschi). A kiadvány tartalma nem feltétlenül tükrözi az USDA nézeteit vagy politikáját, és a kereskedelmi nevek, kereskedelmi termékek vagy szervezetek említése sem jelenti az Egyesült Államok kormányának jóváhagyását. A szerzőknek nincs más releváns kapcsolata vagy pénzügyi közreműködése olyan szervezetekkel vagy szervezetekkel, amelyek pénzügyi érdekeltséggel rendelkeznek vagy pénzügyi konfliktusban vannak a kéziratban tárgyalt témával vagy anyagokkal, a közzétetteken kívül.

A kézirat elkészítéséhez nem használtak írásbeli segítséget.

Nyílt hozzáférésű

Ez a munka az Attribution-NonCommercial-NoDeratives 4.0 Unported License alatt van licencelve. A licenc másolatának megtekintéséhez látogasson el a http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ oldalra.

A különös figyelmet érdemlő dolgozatokat a következők kiemelték: • érdeklődésre számot tartó; •• jelentős érdeklődés