Új lipoxigenáz az agarikus gombából Agrocybe aegerita: Biokémiai jellemzés és kinetikai tulajdonságok

Szerepek Konceptualizálás, adatgondozás, vizsgálat, írás - eredeti vázlat

Élelmiszerkémiai és Élelmiszer-biotechnológiai Intézet, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Hesse, Németország

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, forrásszerzés, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - eredeti tervezet

Élelmiszerkémiai és Élelmiszer-biotechnológiai Intézetek, Justus Liebig Egyetem Giessen, Giessen, Hesse, Németország, Fraunhofer Molekuláris Biológiai és Alkalmazott Ökológiai Intézet IME Bioresources üzleti terület, Giessen, Hesse, Németország

Ábrák

Absztrakt

Az oxilipinek különböző biológiai funkciójú metabolitok. A bioszintetikus útvonal azonban széles körben ismeretlen. Úgy véljük, hogy az első lépés a többszörösen telítetlen zsírsavak oxigénellátása, mint a linolsav. Ezért az Agrocybe aegerita ehető bazidiomycete-ből származó lipoxigenázt (LOX) vizsgálták. Az AaeLOX4-et heterológ módon expresszáltuk E. coliban, és affinitáskromatográfiával és gélszűréssel tisztítottuk. A tisztított AaeLOX4 biokémiai tulajdonságait és kinetikai paramétereit linolsavval és linolénsavval szubsztrátként határoztuk meg. A kapott linolsav Km, vmax és kcat értéke 295,5 μM, 16,5 μM · min -1 · mg -1 és 103,9 s -1 volt. A linolénsav Km, vmax és kcat értéke 634,2 μM, 19,5 μM · min -1 · mg -1 és 18,3 s -1 volt. A maximális aktivitást pH 7,5 és 25 ° C hőmérsékleten figyeltük meg. A linolsavkonverzió fő termékét normál fázisú HPLC-vel azonosítottuk. Ez az elemzés feltárta a 13-hidroperoxi-9,11-oktadekadiénsav (13-HPOD) kifejezett termelését. A kísérleti regio-specificitást a W384, F450, R594 és V635 aminosavmaradékok támasztják alá, amelyeket relevánsnak tartanak a regio-specificitás szempontjából a LOX-ban. Összegzésként elmondható, hogy a HPLC-analízis és az összehangolások azt mutatták, hogy az AaeLOX4 egy 13-LOX.

Idézet: Karrer D, Rühl M (2019) Az Agrocybe aegerita agarikus gomba új lipoxigenáza: Biokémiai jellemzés és kinetikai tulajdonságok. PLoS ONE 14 (6): e0218625. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0218625

Szerkesztő: Daotai Nie, a Southern Illinois Egyetem Orvostudományi Kar, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2019. február 11 .; Elfogadott: 2019. június 5 .; Közzétett: 2019. június 19

Adatok elérhetősége: Az AaeLOX4 génszekvenciája elérhető a GenBank adatbázisból MK451709 csatlakozási szám alatt.

Finanszírozás: A Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de/en/) 2137/1 RU támogatást az MR kapta. DK és MR a Hessen Állami Felsőoktatási, Kutatási és Művészeti Minisztérium által finanszírozott LOEWE Rovarbiotechnológiai és Bioresources Központ létesítményeit használta (http://www.proloewe.de/en/). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az oxilipinek lipoxigenáz-eredetű metabolitok, amelyek sokféle szerkezettel és biológiai funkcióval rendelkeznek. Ezek a metabolitok megtalálhatók növényekben, emlősökben, baktériumokban, algákban, mohákban és gombákban [1]. Emlősökben részt vesznek az immunválasz szabályozásában. Az elmúlt években az emberi lipid közvetítők, mint pl. A hepoxilinek és a trioxilinek, amelyek fontos szerepet játszanak a szövetek gyógyításában, a szervek védelmében, a fájdalom csökkentésében és a gazda védelmében, nagy figyelmet kaptak [2, 3].

Anyagok és metódusok

Az AaeLOX4 klónozása és fehérje expressziója

A kodonnal optimalizált AaeLOX4 gént (Aaelox4), amelynek eredeti cDNS-jét MK451709 regisztrációs szám alatt raktuk le, kereskedelemben megvásároltuk és klónoztuk a pET28a plazmidba (BioCat GmbH, Heidelberg, Németország). A fehérje expressziójához a pET28a/AaeLOX4 plazmidot E. coli BL21 (DE3) Gold-ba transzformáltuk. Rekombináns E. coli sejteket 12 g triptont, 24 g élesztőkivonatot és 5 g glicerint tartalmazó Terrific Broth táptalajban (TB) tenyésztettünk, szelekciós markerként 50 mg · L -1 kanamicinnel kiegészítve, 37 ° C-on, amíg az OD600 értéke 0,5 elérte. Az expressziót izopropil-β-d-tiogalaktopiranozid hozzáadásával 0,5 mM végkoncentrációig adtuk. Az expresszió hőmérsékletét 24 ° C-ra csökkentettük és további 24 órán át tenyésztettük. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük (4000 g, 30 perc, 4 ° C), és -20 ° C-on tároltuk a további felhasználásig.

Fehérje tisztítása

A sejtpelletet jégen felolvasztottuk és lízispufferben (50 mM foszfát, 300 mM NaCl, pH 7,5) szuszpendáltuk. A sejtek lebontását szonifikációval (3 ciklus 60 másodpercig, 60 másodperc pihenés) jégen szonikátor alkalmazásával (Bandelin Sonopuls, Berlin, Németország) végeztük. A teljes megszakítás után a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk (14 000 g, 30 perc, 4 ° C). A kapott felülúszót kétszer 5 ml HisTrap oszlopra (GE-Healthcare) töltöttük, 5 oszloptérfogatú 25 mM imidazolt tartalmazó lízispufferrel mostuk, és 5 oszloptérfogattal eluáltuk ugyanazzal a pufferrel, amely 500 mM imidazolt tartalmazott. A gélszűrést Superdex 200 16/60 (GE Healthcare) készüléken végeztük, pufferrel, amely 50 mM Tris (hidroxi-metil) amino-metánt (Tris/HCl), 300 mM NaCl, 10% (v/v) glicerint, pH 7,5 és áramlási sebessége 0,2 ml · min -1. Az eluálást 2 ml-es frakciókban összegyűjtöttük és SDS-PAGE-n keresztül elemeztük. A további elemzéshez tisztított Aae-LOX4 frakciókat használtunk.

Lipoxigenáz vizsgálat

A LOX vizsgálat szubsztrát-oldatát az alábbiak szerint állítottuk elő. 10 μl linolsavat vagy linolénsavat adunk 915 μl ddH2O-hoz, amely 15 μl Tween 20 és 60 μl 1 M NaOH-t tartalmaz. Az alikvot részeket -20 ° C-on tároltuk és felhasználás előtt felolvasztottuk. A LOX aktivitást úgy határoztuk meg, hogy a konjugált kettős kötés képződését 234 nm-en (ε = 25 000 M -1 cm-1) rögzítettük nanofotométeren (Implen, München, Németország). A tipikus reakcióelegy 0,5 mM linolsavat, 20 μl enzimoldatot és 50 mM foszfátpuffert (pH 7,5) tartalmazott 1 ml végtérfogatig.

A pH- és hőmérsékletoptimum meghatározása

A pH-optimum meghatározásához három különböző puffert használtunk: 50 mM acetátpuffer, pH 4,5-6; 50 mM foszfátpuffer, pH 6,5–8, és 50 mM borátpuffer, pH 8,5–10. A hőmérséklet hatásait úgy határoztuk meg, hogy a reakcióelegyet 15 ° C és 65 ° C közötti hőmérsékleteken inkubáltuk.

Kinetikai paraméterek

A Michaelis-Menten kinetikát úgy számítottuk ki, hogy a tisztított AaeLOX4-et különböző linolsav- vagy linolénsav-koncentrációkkal 0,025 - 2 mM közötti inkubálással inkubáltuk. Az összes mérést 50 mM foszfátpufferben, pH 7,5 és 25 ° C hőmérsékleten hajtottuk végre. A konjugált kettős kötés kezdeti képződési sebességét 234 nm-en rögzítettük három példányban, és konzultáltunk a Km, vmax és kcat kiszámításához.

Termékelemzés

Az AaeLOX4 termék-specifitását 1 mM linolsav, 20 μl AaeLOX4 és 50 mM foszfátpuffer (pH 7,5) inkubálásával 1 ml végtérfogatban határoztuk meg. A reakció előrehaladását a konjugált kettős kötés kialakulásának rögzítésével követtük 234 nm-en. Az inkubációkat akkor állítottuk le, amikor a kipusztulás további növekedése nem volt kimutatható. A kapott hidroperoxi-linolsavakat 1 ml n-hexán hozzáadásával extraháltuk. A HPLC-analízishez az extraktumokat folyamatos N2-áram alatt szárítottuk, és n-hexán/2-propanol/ecetsavban oldottuk (100/5/1, v/v/v). A normál fázisú HPLC-t Nucleodur SiOH 100–5 oszlopon (Macherey-Nagel; 4,6x250 mm, 5 μm részecskeméret) végeztük izokratikus eluáló rendszerrel, n-hexán/2-propanol/ecetsav (100/5) elegyével./1, v/v/v) 1 ml/perc -1 áramlási sebességgel. Az eluálást 234 nm-en követtük hidroperoxi-zsírsavaknál és 210 nm-nél telítetlen zsírsavaknál. A termék-specifitást a kereskedelemben kapható szójabab LOX-1-gyel készített 13-HPOD és 9-HPOD standardokkal való összehasonlítással értékelték [10]. A kontroll kísérleteket a fent leírtak szerint hajtottuk végre, anélkül, hogy enzimet adtunk volna a reakcióelegyhez.

Eredmények

Az Agrocybe aegerita fekete nyárgomba lipoxigenázai

Az Agrocybe aegerita (más néven Cyclocybe aegerita és Pholiota aegerita) nemrégiben szekvenált genomjában öt feltételezett LOX-t kódoló gént jegyeztek fel és jelöltek LOX1 (AAE3_00896), LOX2 (AAE3_01552), LOX3 (AAE3_09652) és LOX5 (AAE3_07753) ([18], www.thines-lab.senckenberg.de/agrocybe_genome). Az A. aegerita LOX gének levezetett aminosavszekvenciáit, valamint az Ascomycota (Fusarium oxysporum és Gaeumannomyces graminis) és a Basidiomycota (Pleurotus sapidus és Pleurotus ostreatus) már jellemzett gombás LOX-os szekvenciáit használtuk a filogenetikai elemzéshez (http://www.phylogeny.fr/ alapértelmezett paraméterek). A LOX két külön szakaszra vált szét, egyik oldalon a G. graminis [19] jellemzett LOX-jával és a másik oldalon az összes bazidiomycetous LOX-mal, valamint a F. oxysporum [20] jellemzett LOX-jával (S1 ábra). Ez utóbbi csoport három részre oszlott: i) egy nagy klaszter, amely mindkét jellemzett LOX-ot tartalmazta a Pleurotus fajból, és négy feltételezett LOX-ot az A. aegerita-ból (LOX1, LOX2, LOX4, LOX5), ii) LOX3-t az A. aegerita-ból és iii) LOX a F. oxysporumból.

Heterológ expresszió és tisztítás

Aktív és oldható AaeLOX4-et a pET28a/AaeLOX4 plazmidot hordozó E. coli BL21 (DE3) Gold tenyészetből nyertünk. A sejtlizátum SDS-PAGE elemzése azt mutatta, hogy az AaeLOX4 van jelen az oldható lizátum frakcióban (1. ábra). Így a sejtlizátumot közvetlenül egy affinitáskromatográfiás oszlopra vittük fel, ami a nyers szennyeződések eltávolítását eredményezte. Az ezt követő gélszűrés tiszta AaeLOX4-et eredményezett (1. ábra). A fő sáv becsült molekulatömege körülbelül 80 kDa volt, ami megerősítette az aminosav-szekvencia 79 kDa-os előre jelzett molekulatömegét. Összességében 1351-szeres tisztítási hozamot kaptunk (1. táblázat).

M = marker, L = tisztított lizátum, AC = tisztítás affinitáskromatográfia után, GF = tisztított enzim gélszűrés után.

LOX biokémiai tulajdonságok és jellemzők

Az AaeLOX4 aktivitását 15 ° C és 65 ° C közötti hőmérséklet-tartományban határoztuk meg. Míg a relatív aktivitás 25 ° C és 45 ° C között az aktivitás körülbelül ötöde egyenletes elvesztését eredményezte, a további hőmérséklet-emelkedés 55 ° C-ra drámai aktivitásvesztést okozott, és 65 ° C-on nem volt kimutatható aktivitás. A legalacsonyabb elemzett 15 ° C-os hőmérsékleten a maximális LOX-aktivitás egyharmada maradt meg (2. ábra).

Az LOX aktivitási vizsgálatokhoz használt pufferrendszer pH-jának növekedésével egyenletes aktivitásnövelés érhető el, amely maximális értékét 7,5 pH-nál éri el. A pH további növelése drasztikus aktivitásvesztést mutatott, a 9-es vagy annál magasabb pH-értéktől kimutatható aktivitás nélkül. A savas környezetben az AaeLOX4 tolerálhatóbb aktivitási tulajdonságokat mutatott. A pH 7,5-ről 6-ra történő csökkentése körülbelül 20% -os aktivitásvesztést eredményezett. Mindazonáltal pH 5,0 mellett a relatív aktivitás 50% -ra csökkent, míg 20% relatív aktivitás 4,5 pH-n maradt (3. ábra).

50 mM acetátpuffer (négyzetek), 50 mM foszfátpuffer (körök), 50 mM borátpuffer (háromszögek).

Michaelis-Menten-paramétereket a Lineweaver-Burk-féle ábra alapján vontuk le, amely 0,025–2 mM közötti linolénsav- vagy linolénsav-koncentrációval ábrázolja az AaeLOX4 aktivitást (4. ábra). A kapott linolsav Km, vmax és kcat értéke 295,5 μM, 16,5 μM min -1 mg -1, illetve 103,9 s -1 volt. A linolénsav mint szubsztrát esetében a Km értékeket 634,2 μM, 19,5 μM · min -1 · mg -1 és 18,3 s -1 értékekkel számoltuk (2. táblázat). Az AaeLOX4 szubsztrát-specifitását megbecsültük a különböző PUFA-khoz viszonyított relatív aktivitások összehasonlításával (3. táblázat). Az enzim mutatta a legnagyobb specificitást a linolsavra és a relatív aktivitást a linolénsavra (88,8%). Az arachidonsav mutatta a legkisebb relatív aktivitást, 7,3% -kal.

Az értékek a triplikátumok átlagát és szórását jelentik. Az Inset a Lineweaver-Burk cselekményt ábrázolja.

A termékek HPLC-analízise

Az AaeLOX4 specifitását normál fázisú HPLC-vel elemeztük. Az AaeLOX4 elúciós profilja két fő terméket mutat, amelyek 3,12 és 3,81 percnél eluálódnak (5. ábra). A 13-Z, E-HPOD és 13-E, E-HPOD, valamint a 9-Z, E-HPOD és 9-E, E-HPOD szójabab LOX-1-gyel készült Kuribayashi és mtsai. [10]. A 13-Z, E-HPOD és 13-E, E-HPOD 3,33 és 3,79 percnél eluálódik, míg az izomer 9-HPOD keverék egyetlen csúcsként 5,79 percnél eluálódik. A negatív kontroll nem mutatott csúcsokat ezen retenciós időkben. Az AaeLOX4 termékek és a szójabab LOX-1 termékek összehasonlításából kiderült, hogy az AaeLOX4 nagyon specifikus 13-HPOD-ot termel. Az AaeLOX4 által termelt 9-HPOD nem volt kimutatható, és kizárták, ha összehasonlítottuk a szójabab LOX-1-ből 5,79 percnél eluáló 9-HPOD UV-spektrumát az AaeLOX4 termékek elúciós profiljának ezen tartományú csúcsaival.

A kromatogramot 234 nm-en rögzítettük. (A) negatív kontroll. A reakcióelegy kivonata, amely nem tartalmaz enzimet. (B) A reakciótermékek kivonata a szójabab LOX-1-ből. (C) A reakciótermékek kivonata AaeLOX4-ből. (1a) 13-Z, E-HPOD, (1b) 13-E, E-HPOD, (2) 9-Z, E-HPOD + 9-E, E-HPOD.

Vita

Segítő információ

S1. Ábra A különféle gombás LOX filogenetikai elemzése.

Aae — Agrocybe aegerita, Fox - Fusarium oxysporum, Ggr — Gaeumannomyces graminis, Pos — Pleurotus ostreatus, Psa — Pleurotus sapidus; AaeLOX1, AaeLOX2, AaeLOX3, AaeLOX4 (MK451709), AaeLOX5, FoxLOX (KNB01601), GgrLOX (AAK81882), PsaLOX (CCV01580), PosLOX (CCV01578).

S2 ábra. Különböző LOX aminosav-szekvenciák részleges illesztése.

Agrocybe aegerita AaeLOX1, AaeLOX2, AaeLOX3, AaeLOX4, AaeLOX5, Pleurotus sapidus PsaLOX, Pleurotus ostreatus PosLOX, Fusarium oxysporum FoxLOX, Gaeumannomyces graminis GgrLOX. Az összehangolást az alapértelmezett paraméterekkel rendelkező Clustal Omega alkalmazásával hajtottuk végre. A ligandumkötésben résztvevő kiemelt aminosavmaradékokat „L” -ként jelöljük. A sztereo specifitással kapcsolatos aminosavakat "B" [24], "H" [27] és "S" [23].

Köszönetnyilvánítás

Szeretnénk megköszönni a névtelen bírálónak, hogy értékes visszajelzéseket nyújtott, amelyek elősegítették a cikk javítását.