Hogyan működik az SDS-PAGE

Az SDS-PAGE-t (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézis) a laboratóriumban gyakran használják a fehérjék szétválasztására azok molekulatömege alapján. Ez egyike azoknak a technikáknak, amelyeket gyakran használnak, de gyakran nem teljesen értenek meg. Tehát próbáljuk meg kijavítani.

Az SDS-PAGE a fehérjéket molekulatömegük szerint szétválasztja, a szitáló mátrixon (gélen) keresztüli differenciált migrációs sebességük alapján egy alkalmazott elektromos mező hatására.

A fehérjemigráció arányának arányossá tétele a molekulatömeggel

Bármely feltöltött faj mozgását az elektromos mezőn keresztül annak nettó töltése, molekuláris sugara és az alkalmazott tér nagysága határozza meg. De a natívan hajtogatott fehérjék problémája az, hogy sem a nettó töltésük, sem a molekulasugaruk nem függ a molekulatömegtől. Ehelyett a nettó töltésüket az aminosav-összetétel, vagyis a fehérje pozitív és negatív aminosavainak összege és a molekula sugara határozza meg a fehérje harmadlagos szerkezete alapján.

Tehát natív állapotukban különböző, azonos molekulatömegű fehérjék különböző sebességgel vándorolnának elektromos térben, töltésük és 3D-alakjuk függvényében.

A fehérjék elkülönítéséhez az elektromos mezőben csak a molekulatömegük alapján el kell pusztítanunk a tercier struktúrát azáltal, hogy a fehérjét lineáris molekulává redukáljuk, és valahogy elfedjük a fehérje belső nettó töltését. Ott jön be az SDS.

Az SDS szerepe (et al)

Az SDS egy detergens, amely jelen van az SDS-PAGE mintapufferben, ahol egy kis forrás és egy redukálószer (általában DTT vagy B-ME a fehérje-fehérje diszulfid kötések lebontására) mellett megzavarja a fehérjék. Ez az összehajtott fehérjéket lineáris molekulákká alakítja.

Az SDS a fehérjét is egyenletes negatív töltéssel vonja be, amely elfedi az R-csoportok belső töltéseit. Az SDS meglehetősen egyenletesen kötődik a lineáris fehérjékhez (kb. 1,4 g SDS/1 g fehérje), ami azt jelenti, hogy a fehérje töltése most hozzávetőlegesen arányos a molekulatömegével.

Az SDS is jelen van a gélben, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a fehérjék linearizálása és töltéseik elfedése után a futtatás során is így maradnak.

Az SDS-vel bevont fehérje meghatározásának meghatározó tényezője a molekuláris sugara. Kimutatták, hogy az SDS-bevonatú fehérjék lineáris molekulák, 18 angström széles és hosszúságuk arányos a molekulatömegükkel, így a molekulasugarat (és ennélfogva a gélben való mobilitást) a fehérje molekulatömege határozza meg. Mivel az SDS-bevonatú fehérjék töltés-tömeg aránya megegyezik, a töltés alapján nem lesz differenciális migráció.

A gélmátrix

Alkalmazott elektromos térben az SDS-vel kezelt fehérjék molekulatömegüktől függően különböző sebességgel mozognak a pozitív anód felé. Ezeket a különböző mobilitásokat eltúlozzák a gélmátrix nagy súrlódású környezete.

Ahogy a neve is sugallja, az SDS-PAGE-hoz használt gélmátrix poliakrilamid, ami azért jó választás, mert kémiailag inert, és alapvetően könnyen előállítható különféle koncentrációkban, hogy különböző pórusméreteket hozzon létre, különféle elválasztási körülményeket biztosítva. amely az igényeitől függően változtatható. Emlékezhet arra, hogy korábban cikket írtam az akrilamid polimerizációjának mechanizmusáról.

A folytonos pufferrendszer és a halmozó gél - felsorakoztatja őket a rajtvonalnál

Ahhoz, hogy a katódtól (negatív) az anódig (pozitív) áramot vezessünk a gélen keresztül, nyilvánvalóan pufferre van szükség. Leginkább a megszakítás nélküli Laemmli puffer rendszert használjuk. A „folytonos” egyszerűen azt jelenti, hogy a gélben lévő puffer és a tartály eltérő.

A rendszert tipikusan 6,8 pH-értékű, Tris-HCl-del pufferelt, futó géllel, amelyet Tris-HCl-del 8,8-ig pufferoltunk, és elektródpufferrel, pH 8,3-on állítottunk össze. A halmozó gél alacsony akrilamid-koncentrációval, a futó gél pedig magasabb koncentrációval képes késleltetni a fehérjék mozgását.

Tehát mi van a különböző pH-kkal?

Nos, a glicin három különböző töltési állapotban létezhet, pozitív, semleges vagy negatív, a pH-tól függően. Ezt mutatja az alábbi ábra. A glicin töltésállapotának ellenőrzése a különböző pufferek segítségével a kulcsa az egész halmozó gél dolognak.

Tehát itt van, hogyan működik a halmozó gél. Az áramellátás bekapcsolásakor a negatív töltésű glicin-ionok a pH 8,3 elektródpufferben arra kényszerülnek, hogy belépjenek a halmozó gélbe, ahol a pH 6,8. Ebben a környezetben a glicin főleg zwitterionos (semleges töltésű) állapotba kapcsol. Ez a töltésveszteség miatt nagyon lassan mozognak az elektromos mezőben.

A Cl-ionok (a Tris-HCl-ből) viszont sokkal gyorsabban mozognak az elektromos mezőben, és olyan ionfrontot képeznek, amely a glicin előtt vándorol. Cl- és a Tris-elleniontól (amely most az anód felé halad) elválasztva keskeny zónát hoz létre meredek feszültséggradienssel, amely a glicint maga mögött húzza, és két szűken elválasztott frontot eredményez a migráló ionokról; a rendkívül mozgékony Cl- front, amelyet a lassabb, többnyire semleges glicinfront követ.

A gélmintában található összes fehérje elektroforetikus mobilitással rendelkezik, amely a glicin és a Cl- mobilitása szélső része között helyezkedik el, így amikor a két front a mintán jól végigsöpör, a fehérjék a Cl közötti keskeny zónába koncentrálódnak. - és a glicin frontok.

És ki vannak kapcsolva!

Ez a menet addig folytatódik, amíg el nem éri a futó gélt, ahol a pH 8,8-ra vált. Ennél a pH-nál a glicinmolekulák többnyire negatív töltésűek és sokkal gyorsabban tudnak vándorolni, mint a fehérjék. Tehát a glicinfront felgyorsul a fehérjék mellett, így a porban marad.

Ennek eredményeként a fehérjék egy nagyon keskeny sávban dömpingelnek a halmozó és a futó gélek határán, és mivel a futó gélnek megnövekedett akrilamidkoncentrációja van, ami lassítja a fehérjék mozgását méretük szerint, megkezdődik az elválasztás.

Miről volt szó?

Ha még mindig kíváncsi arra, hogy miért van szükség a halmozó gélre, gondoljon bele, mi történne, ha nem használna ilyet.

A géllyukak körülbelül 1 cm mélyek, és általában jelentősen meg kell tölteni őket, hogy elegendő fehérje jusson a gélre. Tehát halmozó gél hiányában a mintája a futó gél tetején ül, akár 1 cm mély sávként.

Ahelyett, hogy összeállnának és összeütnék a futó gélt, ez azt jelentené, hogy a mintában szereplő fehérjék mind különböző időpontokban kerülnének a futó gélbe, ami nagyon elkenődött sávokat eredményezne.

Tehát a halmozó gél biztosítja, hogy az összes fehérje egyszerre érkezzen a futó gélhez, így az azonos molekulatömegű fehérjék szoros sávokban vándorolnak.

Elválasztás

Miután a fehérjék a gélben vannak, elválnak, mert a nagyobb molekulatömegű fehérjék lassabban mozognak a porózus akrilamid gélen, mint az alacsonyabb molekulatömegű fehérjék. A gélben lévő pórusok mérete az elválasztani kívánt fehérjék méretétől függően megváltoztatható az akrilamid-koncentráció megváltoztatásával. A tipikus értékeket az alábbiakban mutatjuk be.

Szélesebb szétválasztási tartomány vagy nehezen szétválasztható fehérjék esetében gradiens gélt használhatunk, amelynek növekvő akrilamid-koncentrációjú rétegei vannak.

Szerintem ennyit jelent a Laemmli SDS-PAGE. Ha bármilyen kérdése, javítása vagy bármilyen további hozzáfűznivalója van, kérjük, vegyen részt a megjegyzések részben!

Eredetileg 2008. szeptember 18-án jelent meg. Felülvizsgált és frissítve 2016. június 20-án.

Segített neked? Ezután kérjük, ossza meg hálózatával.