Leishmania A homoklégy táplálkozási magatartásának manipulálása fokozott továbbítást eredményez

¤ Jelenlegi címe: Imperial College London, Immunológiai Tanszék, London, Egyesült Királyság

Tagság Liverpool Trópusi Orvostudományi Iskola, Liverpool, Egyesült Királyság

* Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: [email protected]

Tagság Liverpool Trópusi Orvostudományi Iskola, Liverpool, Egyesült Királyság

Ábrák

Absztrakt

A természetben a teljes homoklégy populációkban a Leishmania fertőzés előfordulási gyakorisága nagyon alacsony lehet (a Leishmania mexicana a homoklégy vektor béléből regurgitálódik, parazita eredetű viszkózus gélszerű anyag kíséretében [7]. Ez a promastigote szekréciós gél (PSG) ) egy erős parazita virulencia faktor, és a homok légy nyálával együtt jelentősen fokozza a bőrfertőzéseket, amikor együtt szállítják az emlős gazdaszervezet bőrébe [7,8]. A betegség súlyosbodásáért felelős gél fő eleme a fonalas proteofoszfoglikán (fPPG), egy nagyon nagy molekulatömegű glikoprotein, amely egyedülálló a Leishmania esetében [9].

A parazita ezen különféle, korábban leírt hatása a homoklégy gazdára elősegíti a gazda-vektor érintkezést és transzmissziót, és így potenciálisan előnyös a parazita számára, de a fertőzés hasznos mellékterméke, nem pedig a valódi manipuláció példája. Sőt, fontos szem előtt tartani, hogy a gazdaszervezet érintkezése és a vérellátás nem jár kockázat nélkül, és jelentős veszélyt jelent mind a vektor, mind a paraziták számára, amikor a gazda védekezik [19], ezért nem világos, hogy ezen hatások bármelyike bekövetkezik-e. szelektíven előnyösek. Egy ilyen forgatókönyv szerint az átviteli lehetőségek időzítése kritikus az elpusztulás kockázatának minimalizálása érdekében, és a vektor túlélésének elősegítése ahhoz, hogy a parazita fertőzőképessé váljon [1,2,19,20]. Ebben a tanulmányban a Leishmania-fertőzött homoklegyek viselkedését vizsgáljuk. Leírunk egy elegáns és újszerű példát a viselkedési manipulációra, amelyben a parazita fejlődés időzítése a homoklégy vektor táplálkozási perzisztenciájához kapcsolódik, és bemutatjuk, hogy egy ilyen stratégia fokozza a Leishmania átvitelét.

Eredmények/Vita

A Leishmania fertőzőképességüket a géldugó kialakulása során szerzik meg

(A) A legyeket megfertőztük L. mexicana (kitöltött négyzetek) vagy L. infantum (kitöltött körök) amasztigótákkal, naponta tíz legyet gyűjtöttünk csoportonként, és meghatároztuk a metaciklusok/légy átlagos számát. A hibasávok 1 s.m.-t jelentenek.

(B) Az fPPG felhalmozódása a fertőzött homoklégyek belében. Az L. mexicana (felső panel) vagy az L. infantum fertőzött legyek közepes bélhomogenizátumai SDS-PAGE-val analizálva és immunfolt segítségével AP3 mAb-t alkalmazva kimutatták az fPPG-glikánok jelenlétét. A C sáv a 7. napon nem fertőzött, vérrel táplált kontrollminta.

(C) Metacyclogenesis L. mexicana exponenciális fázissal fertőzött homoklegyekben (zárt négyzetek) vagy álló fázisokban (fél négyzetek) tenyésztett amastigóták. A hibasávok 1 s.m. A csillagok statisztikailag szignifikáns különbségeket jeleznek (p L. mexicana exponenciális fázis (felső panel) vagy állófázisú (alsó panel) amasztigóták, amelyeket SDS-PAGE-val elemeznek, és immunblott segítségével AP3.

A Leishmania csökkenti vektoraik élettartamát

(A) Normális rovarellenes körülmények. A legyeket csak nyúlvérrel (kitöltött négyzetek), L. mexicana lézió amastigótákat (nyitott háromszög) vagy L. infantum lép amasztigóták (nyitott kör) tartalmazó vért táplálták. A 300 etetett nőstény legyet tartalmazó csoportokat naponta ellenőriztük az új halálozások előfordulása szempontjából.

(B) Stressz állapotok. A kísérletet az (A) pont szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy a legyeket naponta stresszeltük úgy, hogy 16 ° C-on inkubáltuk őket cukorliszt nélkül 2 órán át, és 30 percen keresztül repülésre kényszerítettük őket, folyamatosan rázva a ketrecet.

(C) Az L. mexicana fejlődési sebességének hatása a homoklégy vektor túlélésére. A legyeket L. mexicana exponenciális fázissal (felfelé nyitott háromszög) vagy állófázisban (lefelé nyitott háromszög) tenyésztett amasztigótákkal fertőztük, és normál rovarkörülmények között tartottuk fenn.

(D) A kísérletet a (C) pont szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy a legyeket naponta stresszeltük, az (A) pontnál leírtak szerint.

Leishmania Ne változtassa meg a homokrepülés termékenységét

Ezután megvizsgáltuk a Leishmania lehetséges hatásait a termékenységre, mivel bizonyos vektorok fertőzése (például a szúnyogokban előforduló malária) csökkentheti a szaporodási képességet azáltal, hogy kevesebb petesejtet termel [2]. A szúnyogok esetében felmerült, hogy ez kompenzációs mechanizmus lehet a csökkentett élettartam enyhítésére azáltal, hogy az erőforrásokat átirányítják, amelyeket egyébként a tojástermeléshez és a tojásrakáshoz használnának, lehetővé téve a parazita számára, hogy teljes mértékben kifejlődjön fertőző sporozoit formákra. Amikor azonban megvizsgáltuk ezt a lehetőséget, az itt leírt Leishmania fertőzések egyike (L. mexicana/L. infantum, stresszes vagy stresszmentes) egyiknek sem volt jelentős hatása a tojástermeléssel mért azonnali reproduktív alkalmasságra (S1. Táblázat), jelezve, hogy ez nem a Leishmania által ebben a vektorban alkalmazott stratégia.

Hipotézis: A leishmaniával fertőzött homoklegyek a vérellátásban állandóbbak

A Leishmania manipulálja a homoklegyek vérellátását

(A) A metaciklusos promasztigóták száma közötti kapcsolat Lu-ban. longipalpis és táplálkozási perzisztencia. A legyeket L. mexicana (zárt kör) vagy L. infantum (nyitott háromszög) amastigótákkal fertőzték meg. 4 nappal a fertőzés utáni legyek táplálkozási perzisztenciáját megvizsgáltuk egy 10 perces viselkedési vizsgálattal, majd boncoltuk a jelenlévő metaciklusos promastigoták teljes számának meghatározása céljából. Az egyes légyek táplálkozási perzisztenciáját ábrázoljuk az általuk hordozott metaciklusos promastigóták számával szemben. Lineáris korrelációs együttható, r 2 = 0,504 L. mexicana (L. m) és 0,705 L. infantum (L. i) esetében.

(B) Az L. infantum-fertőzött legyek táplálkozási perzisztenciája önmagában (nyílt négyzet) vagy L. infantum amastigotákkal (zárt négyzet) fertőzött nyúlvérrel. Naponta megfigyeltük az anesztetizált egérnek egyedileg kitett legyek perzisztenciáját. n = 16 homok repül egy ponton, ami két független kísérlet kombinációját képviseli. Hibasávok 1 pl.

(C) L. mexicana-fertőzött legyek táplálkozási perzisztenciája, kísérleti tervezés (B) pont szerint. A legyeket nyulavérrel etették egyedül (nyitott négyzet) vagy L. mexicana-val (zárt kör) fertőzve.

A leishmaniával fertőzött homokrepülők több házigazdával táplálkoznak

(A) A légyből származó L. mexicana metaciklusos promastigóták fertőzősége A legyeket exponenciális fázissal vagy állófázisú L. mexicana tenyésztett amastigótákkal fertőztük meg, a fertőzéseket hagytuk érlelődni (7. nap), majd metaciklusos promastigótákat kaptunk, megmostunk és 10 3 parazitát injektáltunk minden BALB/c egér jobb lábába. Két, hat egérből álló csoport adatait mutatjuk be, amelyek exponenciális fázisból (zárt négyzet) vagy álló helyzetű fázisból (fél négyzet) származó fertőzésekből származó metaciklusos promastigotákkal fertőzöttek.

(B és C) A táplálkozási perzisztencia hatása az egerek Leishmania fertőzésére. A legyeket exponenciális (zárt négyzet vagy nyílt négyzet) vagy állófázis (zárt kör vagy nyílt kör) fertőzte meg L. mexicana tenyésztett amastigótákkal. A 7. napon fertőzött legyeket egyedileg altattuk az altatott BALB/c egerek jobb mancsán, és hagytuk 15 percig etetni ([B], zárt kör vagy zárt négyzet) vagy ([C], nyitott négyzet vagy nyitott kör) nélkül félbeszakítás.

Következtetések

Korábban azt javasolták, hogy a Leishmania paraziták elülső részével való érintkezése megzavarhatja a véráramlást észlelő mechanoreceptorok működését, és ez magyarázhatja a legyek csökkent képességét vérételre [4,30]. Az itt bemutatott eredmények fényében azonban azt javasoljuk, hogy ezeknek a mechanoreceptoroknak a működését rontja az fPPG, amely a manipulátor molekula szerepét tölti be. Ez pedig elősegítheti az éhség állapotot és a légy tartósságát, vagy megnövelheti azt a vérmennyiséget, amelynél a vérkeresési magatartás gátolt. Jelenleg genomikai megközelítést alkalmazunk a fertőzés homoklegyekre gyakorolt hatásának vizsgálatára, amely lehetővé teheti számunkra a manipulációban részt vevő gének azonosítását. Végül arra törekszünk, hogy megvizsgáljuk a manipuláció szerepét a terepen.

Anyagok és metódusok

Leishmania kultúra és morfológia.

Az L. mexicana-t (MNYC/BZ/62/M379) vagy az L. infantum-ot (syn. Leishmania chagasi) (MHOM/BR/76/M4192) tenyésztettük az előzőekben leírtak szerint [22,32]. A paraziták formalinnal rögzített mintáit Neubauer hemocyctometer alkalmazásával számoltuk meg, és fejlődésük morfológiáját Rogers et al. Rendszerének felhasználásával Giemsa-festett kenetből származó paraziták mérésével értékeltük. [17].

Homok légyfertőzés és túlélés.

Az ötnapos Lutzomyia longipalpis (Jacobina törzs) nőstény homoklegyeket L. mexicana vagy L. infantum amastigotes fertőzte meg mesterséges membrán-etető rendszeren keresztül, 2 × 106 amasztigóta/ml sűrűségben, friss nyúlvérben [33]. A L. mexicana amastigotákat a nőstény BALB/c egerek farlézióiból gyűjtöttük, a L. infantum amastigotákat pedig a BALB/c egerek lépéből izoláltuk. Néhány kísérletben az L. mexicana amastigotákat axenikusan tenyésztették a felhasználás előtt [34]. A vérrel táplált legyeket elválasztották és 12 órás fény: sötét ciklus alatt tartották 28–30 ° C-on, 80–95% relatív páratartalom mellett, és 70% (w/v) szacharózzal látták el ad libitum. A legyektől megtagadták a tojásrakás lehetőségét az ovipozíció utáni mortalitás minimalizálása érdekében [16], és minden érett fertőzéssel rendelkező boncolt legynél megfigyelték a petesejteket (gravid). Bizonyos kísérletek során a nőstény legyeket napi szinten megterhelték úgy, hogy 2 órán át 16 ° C-on inkubáltuk őket cukorliszt nélkül, és 30 percen át repülésre kényszerítették őket a ketrec felkavarásával. A homoklégy túlélésének felmérése érdekében a ketreceket naponta ellenőrizték az új halálozások előfordulása szempontjából. A túlélési adatok statisztikai elemzését log rang teszt segítségével végeztük [35].

PSG felhalmozódás.

Összegyűjtött fertőzött homoklégy homogenizátumokat immunblotoltuk az fPPG kimutatására AP3 monoklonális antitest alkalmazásával, a korábban leírtak szerint [7].

Harapós perzisztencia teszt.

Második gazda választási teszt.

A perzisztencia-vizsgálat módosított formáját alkalmazták, amelyben a legyeket egyedileg vizsgálták, hogy megszakítás esetén alternatív gazdaszervezettel táplálkoznak-e. Két érzéstelenített BALB/c egeret egymástól 10 cm-re tartottak egy 25 cm 3 -es ketrecben, és egyetlen legyeknek tették ki őket. Amikor egy légy elkezdte táplálni az egeret, még egy percig engedélyezték, mielőtt megszakította volna. Ezt követően a légy 10 másodpercenként megszakadt, ha megpróbálta ugyanazon egérrel táplálkozni. Az etetés megszakítását addig hajtottuk végre, amíg vagy a légy nem kezdett etetést a szemközti egérrel, vagy amíg 15 perc nem telt el. A legyek etetését megakadályozták az antennák kíméletes ecsetelésével az etetési kísérletek között. A vizsgálat után a legyeket boncoltuk, hogy adott esetben megerősítsük a fertőzést.

Egerek fertőzése.

A nőstény BALB/c egereket megfertőztük vagy 10 3 metaciklusos promastigóta injekciójával tűvel a jobb hátsó láb hátsó felületébe, vagy lehetővé téve, hogy az egyes fertőzött homoklégyek ugyanazon a helyen harapjanak [7]. Az elváltozás kialakulását a jobb láb duzzadásának mérésével vizsgáltuk Vernier féknyergekkel, és levontuk az ellenoldali, nem fertőzött láb szélességét. A kísérletek végén az egereket emberségesen eutanizálták, és a lábak parazita terhelését meghatározták vagy hemocitométeres közvetlen számlálással, vagy a hígítás korlátozásával. Az állatokkal kapcsolatos összes eljárást egy helyi Állatvédelmi Bizottság hagyta jóvá, és az Egyesült Királyság Kormányának (Belügyminisztérium) és az EK előírásainak megfelelően hajtották végre. Az egyes egerek szekvenciális méréseivel kiszámítottuk a görbe alatti területet az elváltozás vastagságának ábrájára az idő függvényében [36]. Az értékek eloszlása a Shapiro-Wilk teszt alkalmazásával nem mutatott bizonyosságot a nem normalitásról, ezért paraméteres elemzést végeztek (t tesztek). A nullhipotézist elutasították, ha a p L. mexicana fertőzés a homoklegyek által kapott vérétel mennyiségére vonatkozik

Valamennyi legyet membrántáplálással 2x106 elváltozású amastigótával fertőztük meg/ml nyúlvérben. A 4–10 d éves fertőzésű legyeket egyedileg egyetlen altatott egérnek tették ki, és a boncoláskor feljegyezték egy etetési kísérlet után kapott vérlisztük relatív nagyságát (sem részleges, sem teljes), miután az összes etetési kísérletet elvégezték. paraziták minden légyben. Az adatokat több kísérletből összesítik.

S4. Táblázat Az L. infantum fertőzés hatása a homoklegyek által nyert vérétel mennyiségére

Valamennyi legyet membrántáplálással 2x106 lép amasztigótával fertőztük meg/ml nyúlvérben. A 4–10 d éves fertőzésű legyeket egyedileg egyetlen altatott egérnek tették ki, és a boncoláskor feljegyezték egy etetési kísérlet után kapott vérlisztük relatív nagyságát (sem részleges, sem teljes), miután az összes etetési kísérletet elvégezték. paraziták minden légyben. Az adatokat több kísérletből összesítik.

Köszönetnyilvánítás

Hálásan köszönjük Davina Moor és Jonathan Archer technikai segítségét.

Szerző közreműködései

A MER és a PAB megtervezte és megtervezte a kísérleteket, elemezte az adatokat és megírta az írást. A MER elvégezte a kísérleteket.

Hivatkozások

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Parazita betegségek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Homok repül" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Leishmania" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Amastigotes" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Vér" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Promastigotes" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Vektor által terjedő betegségek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Leishmania infantum" alkalmazható erre a cikkre? igen nem