Második generációs foszfohisztidin-analóg foszfohisztidin-antitestek előállítására

Publikációs előzmények

Cikk nézetek

Altmetrikus

Idézetek

A cikknézetek a teljes szöveges cikkletöltések COUNTER-kompatibilis összege 2008 novembere óta (mind PDF, mind HTML) az összes intézményben és magánszemélyben. Ezeket a mutatókat rendszeresen frissítik, hogy tükrözzék az elmúlt napokig tartó felhasználást.

Az idézetek a cikkre hivatkozó egyéb cikkek száma, a Crossref által kiszámítva és naponta frissítve. További információ a Crossref hivatkozási számáról.

Az Altmetric Attention Score egy kvantitatív mértéke annak a figyelemnek, amelyet egy kutatási cikk online kapott. A fánk ikonra kattintva az altmetric.com oldal egy oldalt tölt be, amely további részleteket tartalmaz az adott cikk pontszámáról és a közösségi média jelenlétéről. További információ az Altmetric Attention Score-ról és a pontszám kiszámításáról.

Absztrakt

A fehérje hisztidin-foszforilációja döntő szerepet játszik a sejtjelzésben és a központi anyagcserében. Részletes funkciói azonban továbbra is megfoghatatlanok a foszfohisztidint (pH-t) hordozó fehérjék kimutatásának és izolálásának technikai kihívásai miatt, amelyek labilis poszttranszlációs módosítás (PTM). Ennek a kérdésnek a kezelésére korábban kifejlesztettük az első pHis-specifikus antitesteket, stabil, szintetikus triazol alapú pHis analógok felhasználásával. Egy második generációs, pirazol alapú pH-analóg, amely lehetővé tette egy sokkal jobb pH-specifitású pan-pHis antitest kifejlesztését.

A fehérje foszforilációja egy átfogóan vizsgált poszttranszlációs módosítás (PTM). A PTM-t magában foglaló aberráns sejtjelzés számos emberi betegséghez kapcsolódott, beleértve a rákot is. (1) Míg a foszforiláció különböző nukleofil aminosav-oldalláncokon fordulhat elő, a reflektorfény elsősorban a szerin (pSer), a treonin (pThr) foszfoésztereire összpontosított, és tirozin (pTyr).

A pSer, a pThr és a pTyr hatalmas tapasztalataival ellentétben a N-a foszforilezett aminosavak, mint például a foszfohisztidin (pH-érték), a foszfoarginin (pArg) és a foszfolizin (pLys), továbbra sem voltak feltárva. (2) Ezen N-foszforilált PTM-ek közül egyértelmű pH-biológiai szerepet játszanak a sejtek szignáltranszdukciójában és a központi anyagcserében, (3) és bizonyítékok az epigenetikában, (4) a G-fehérje szignálozásában, (5) és az ionvezetésben (6) való részvételéről is.

Annak ellenére, hogy egyre növekszik a pHis biológiai szerepeinek értékelése, továbbra is jelentős akadályok állnak fenn, amelyek akadályozzák az ezen a területen folytatott vizsgálatokat, nevezetesen (1) a pHis kötés belső instabilitását (7) savas körülmények között, amelyeket gyakran alkalmaznak a biokémiai és foszfoproteomikus munkafolyamatok (8) és (2) a biológiai minták pH-jának kimutatására és elemzésére irányuló kutatási eszközök hiánya.

Ezen analitikai hiányosságok orvoslása érdekében nemrégiben kifejlesztettük az első pan- és szekvencia-specifikus pHis antitesteket. (9) Sikerünk a pH-hidrolizálhatatlan szintetikus analógjainak hapténként történő felhasználásától függ, amely stratégia legyőzi az in vivo bomlást. problémák, amelyek kizárják a natív PTM alkalmazását az antitestek előállításában. (2a) Triazol-alapú analógok, mint például a pTza (2) és a pTze (3) célja a pH-k szerkezetének és elektronikájának utánzása (1), miközben a kémiailag labilis foszforamidátkötést stabilabb foszfonáttal helyettesítettük (1. ábra). Következésképpen ezek a szintetikus haptének sikeresen kiváltották az immunválaszokat a gazdaállatokban olyan antitestek létrehozására, amelyek keresztreakcióba léptek a natív pHis fehérjékkel is.

Míg a triazol alapú analógok hasznos pHis-specifikus antitesteket eredményeztek, ezeknek a reagenseknek van néhány hiányosságuk. Először is, az ezen első generációs pHis-analógok alkalmazásával nyert ellenanyagok kissé alacsonyabb affinitással rendelkeznek a natív pH-k iránt, mint maga az analóg. Másodszor, és ami még fontosabb, az antitestek enyhe keresztreaktivitással rendelkeznek a pTyr-rel szemben, (9b) potenciálisan korlátozva az emlősök biológiájának alkalmazását, ahol a pTyr-t tartalmazó fehérjék erős háttérszignálokat eredményezhetnek.

Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy eredeti triazol alapú pH-analógunk nem tökéletes utánzata a natív pH-nak, ami arra késztet bennünket, hogy más analógok potenciális hapténeként való alkalmazását fontolóra vegyük. Ennek megfelelően rátértünk egy pirazol alapú pH-analógra, a pPye-ra (foszfono-pirazolil-etil-amin, 4 (1. ábra). (10) A pPye pirazolmagja megtartja a C2-helyzetben található C – H csoportot pH-értékben, míg ebben a helyzetben nitrogénatom van jelen a pTza-ban és a pTze-ben. A DFT-számítások (11) (1. ábra) azt mutatják, hogy a triazol-analógokban lévő többlet nitrogén finom alakbeli különbségekhez (C – H vs N magányos pár) és elektronikához (nagyobb polarizáció a triazolban) vezet. Ezenkívül a pirazolil-foszfonátokról ismert, hogy pK1,8 és 6,7 értékek (12), és ezért elsősorban dianionos formában kell lenniük, mint a pHis, fiziológiás pH-n. (7) Ezen megfontolások alapján arra számítottunk, hogy a pPye a pH-érték jó utánzata lesz.

1.ábra

1. ábra. Foszfohisztidin (pH =, 1) és stabil analógjai. Bemutatjuk a fejcsoportok szerkezetét és kiszámított elektrosztatikus térképét (színes).

Ezzel a kivitelben a pPye-t könnyen hozzáférhető anyagokból készítették. Az ismert foszfonopirazol (13)5. kereskedelemben kapható bromiddal alkilezett 6.. Ezt követő globális védőcsoport eltávolítás HBr-rel ecetsavban pPye-t kapott (4) jó hozammal (1. séma). PH-függő kémiai eltolódás mérésekkel megerősítettük, hogy a foszforilcsoport a 4 fiziológiai pH-n dianionos állapotban van, hasonló a natív pH-hoz (1. ábra).

1. séma

A pPye-t elsődleges amincsoportján keresztül konjugáltuk a hordozófehérjével, a kulcslyuk-limpet hemocianinnal (KLH), és immunogént használtuk nyulakban antitestképződéshez. A nyúl antiszérum pHis-kötő antitestjeit azután affinitással tisztítottuk immobilizált pHis-szarvasmarha-szérumalbuminon (BSA-pHis) (2. kiegészítő ábra). Ezeket az affinitással tisztított antitestek pH-specifitását más foszfo-aminosav-típusokkal szemben enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) teszteltük (2. ábra). A pPye-eredetű antitestek sokkal nagyobb kötési affinitást mutattak a BSA-pH-hoz képest más foszfoaminosavak BSA- vagy BSA-konjugátumaihoz képest. Nevezetesen, az új antitestek sokkal jobb specifitást mutattak a pH-ra a pTyr felett, összehasonlítva az első generációs pTze-eredetű antitestünkkel (Ab 1.0) (2. ábra). Ezenkívül a pPye-eredetű antitestünk még jobb szelektivitást mutatott a pSer vagy a pThr felett, mint egy kereskedelmi forgalomban lévő pan-pTyr antitest (4G10) (2. ábra). Szintetikus foszfopeptideket alkalmazó pötty-blot vizsgálatok a pPye-eredetű antitestek szelektivitásának javulását is jelezték az Ab 1.0-hoz képest (3. kiegészítő ábra).

2. ábra

2. ábra: A pPye-eredetű pHis antitest, az első generációs pTze-eredetű pHis antitest (Ab 1.0) és a pTyr antitest (4G10) ELSA-vizsgálata BSA, BSA-pHis, BSA-pTyr, BSA-pSer, BSA-pThr, és BSA-pPye szubsztrátok (n = 4; ± s.d).

Annak tesztelésére, hogy a pPye-eredetű pHis antitestek szekvenciától függetlenek-e, Western blot elemzést végeztünk ismert pHis fehérjék sorozatán (3. ábra). Ezeket a fehérjéket enzimatikusan foszforiláltuk (foszfoglicerát-mutáz 1 (PGAM1) és foszfoenol-piruvát-fehérje foszfotranszferáz (PtsI)), vagy kémiailag foszforiláltuk (hiszton H4) szelektíven hisztidinnel. Mivel a natív H4 hisztonon két hisztidin-hely található, amelyek kémiailag foszforilezhetők (His-18 és His-75), ezáltal megzavarva az antitest szekvencia-specifitásának vizsgálatára irányuló képességünket, egyetlen hisztidint tartalmazó H4 hisztont használtunk, ahol a His-75 helyét alaninná mutattuk (hiszton H4 H75A). Örvendetes, hogy az általunk tesztelt összes fehérje robusztus jeleket mutatott, amikor foszforiláltak a hisztidinen, míg a foszforilálatlan fehérjék nem (3a. Ábra). Ezenkívül a hidroxil-amin hozzáadása a foszforilezett fehérjékhez, ami a pH-érték szelektív defoszforilezéséhez vezet, a Western blot segítségével történő kimutatás elvesztését eredményezte. A pH-helyek körüli peptidszekvenciák a töltés és a hidrofobicitás szempontjából sokféleséget mutatnak, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy az antitest valóban szekvenciafüggetlen (3b. Ábra).

3. ábra

3. ábra (a) Western blot elemzés in vitro foszforilezett fehérjék. A bal oldali panel a pPye-eredetű antitestet használó Western-blotot mutatja, a jobb oldali panel pedig a membrán Coomassie-foltja, amely töltés-kontrollként szolgál. Vegye figyelembe, hogy a hiszton H4 esetében megfigyelt dimer sáv (∼22 kDa) valószínűleg az aggregációnak köszönhető (lásd: Támogató információk). (b) A pHis helyek körüli aminosav szekvenciák.

Összefoglalva: sikeresen kifejlesztettünk egy második generációs pan-pHis antitestet. Ezt a pPye, egy pirazol-alapú stabil pH-analóg molekuláris kialakítása és szintézise tette lehetővé, amely bemutatásunk szerint hatékony haptenként szolgál az antitestek előállításához. Fontos, hogy ennek az új antitestnek a pH-specifitás javulása a pTyr-hez képest és szekvencia-független módon magas a pHis-fehérjék iránti affinitása. Tekintettel az egyre növekvő érdeklődésre a pH-t tartalmazó fehérjék emlősök biológiájában, ideértve a rák anyagcseréjét is (14), azt várjuk, hogy ez az antitest értékes adalék lesz a hisztidin-foszforilezés kutatási eszközeinek arzenáljában. Folyamatban vannak a hisztidin-foszforiláció szerepének feltárása az emlősök biológiájában.

segítő információ

Kiegészítő ábrákat, kísérleti eljárásokat és jellemzési adatokat közölünk. Ez az anyag ingyenesen elérhető az Interneten a http://pubs.acs.org címen.

Felhasználási feltételek

Az elektronikus támogató információs fájlok ACS Web Editions előfizetés nélkül állnak rendelkezésre. Az American Chemical Society szerzői jogi tulajdonjoggal rendelkezik minden szerzői jogi védelem alatt álló támogató információval kapcsolatban. Az ACS webhelyéről elérhető fájlok csak személyes használatra tölthetők le. A felhasználók az Amerikai Vegyes Társaság engedélye nélkül más módon nem engedélyezhetik az ACS webhelyéről származó bármilyen támogató információ reprodukálását, újbóli közzétételét, terjesztését vagy értékesítését, részben vagy egészben, géppel olvasható formában vagy bármilyen más formában. Az anyag sokszorosításához, újraközléséhez és terjesztéséhez való engedélyhez a kérelmezőknek a RightsLink engedélyezési rendszeren keresztül kell feldolgozniuk saját kéréseiket. A RightsLink engedélyezési rendszer használatával kapcsolatos információk a következő címen találhatók: http://pubs.acs.org/page/copyright/permissions.html.

Szerző információk

J.-M.K. és R.C.O. egyformán járult hozzá.

A szerzők kijelentik, hogy nincs versengő pénzügyi érdekük.

Elismerés

Ezt a munkát az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete (5R01GM095880) finanszírozta. R.C.O. és J.-M.K. az Országos Egészségügyi Kutatóintézetek Díja (1F32CA167901) és a Damon Runyon Rákkutató Alapítvány (DRG-2005-09) posztdoktori ösztöndíjaival támogatták.

Hivatkozások

Ez a cikk további 14 publikációra hivatkozik.

Kapcsolódó példát lásd:

Spartan ′08 szoftvercsomagot használtak.

Idézi

Ezt a cikket 24 publikáció idézi.

Absztrakt

1.ábra

1. ábra. Foszfohisztidin (pH =, 1) és stabil analógjai. Bemutatjuk a fejcsoportok szerkezetét és kiszámított elektrosztatikus térképét (színes).