Patológiai, immunhisztokémiai és molekuláris leletek kereskedelmi tojótyúkoknál és a hátsó udvarban

Preis IS I; Fiúza ATL I; Silva CC I; Braga JFV I; Couto RM I; Martins NR da S II; Ecco R I

I Setor de Patologia Veterinária, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627, Belo Horizonte, MG 30123-970, Brazília
II Setor de Doenças das Aves, Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva, Escola de Veterinaria, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, 30123-970, Brazília

Kulcsszavak: Madárfertőző laryngotracheitis, hagyományos PCR, hisztopatológia, immunhisztokémia, tojótyúk

BEVEZETÉS

ANYAG ÉS MÓDSZEREK

Ebben a tanulmányban összesen 78 csirkét elemeztek. A rétegeket hét kereskedelmi gazdaságból választották ki, Brazília déli Minas Gerais állam négy különböző településén. Minden réteg HyLine törzs volt, és a mintákat a fektetés különböző szakaszaiban, 19-70 hetes korban gyűjtöttük. A 78 rétegű csirkék közül tizennyolcot előzőleg Preis értékelt et al. (2013), és további vizsgálatoknak vetették alá őket, és a jelen tanulmányban újra elemezték őket. Öt-hat madárból vettünk mintát az akut légzőszervi betegségek minden klinikai epizódja során. A csirkék számát és az egyes gyűjtések idejét az 1. táblázat mutatja. Ezenkívül nyolc háztáji csirkét is felvettek a szomszédos fertőzött gazdaságokból.

Mintagyűjtés hisztopatológiához

A 78 rétegű csirkék gégéjét, légcsövét, tüdejét, légzsákjait, orrmelléküregeit és turbináit, agyát, trigeminus ganglionjait és kötőhártyáját összegyűjtöttük és 10% -os pufferolt formalinban rögzítettük, legfeljebb 52 órán át. A szövetmintákat ezután 70% -os etanolba helyeztük és rutinszerűen feldolgoztuk. A légcső gégéjét és koponyarészét keresztirányban, míg a légcső disztális részét hosszanti irányban levágtuk, hogy lehetővé tegyük az anatómiai részek azonosítását a hisztopatológiai elemzés során.

Hisztopatológia

Az összesen 86 csirkéből kapott formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetmintákat 4 µm vastag szakaszokra vágtuk, hematoxilinnal és eozinnal festettük (Luna 1968), és fénymikroszkóppal értékeltük.

Immunhisztokémia

DNS-kivonás

Az egyes rétegű csirkékből származó egyetlen FFPE-szövetet, beleértve a gégét/légcsövet, a turbinátokat és az orrmelléküregeket, a tüdőt, a trigeminus ganglionokat és a kötőhártyát, öt mikrométer vastagságúra vágtuk (20 szakasz). A szöveti metszeteket ezután mikrocsövekbe helyeztük és paraxinmentesítettük xilollal a DNS kivonása céljából. Ezenkívül nyolc háztáji csirke légcsőjéből és trigeminus ganglionjából származó DNS-t is kinyerték a fent leírtak szerint. Vékonyabb részt vágtunk, hogy biztosítsuk és javítsuk az emésztést a proteináz K-val a DNS-kivonáshoz, a gyártó utasításainak megfelelően QIAamp® DNS FFPE szövetkészlet (Qiagen, Valencia, Kalifornia - USA).

Polimeráz láncreakció

A 78 rétegű csirke és a nyolc háztáji csirke parafinizált mintáiból kivont DNS-t PCR-rel teszteltük a GaHV-1 ICP4 gén 237 bp-os fragmenseinek amplifikálására tervezett primerek alkalmazásával, a Preis által korábban leírt körülmények között. et al. (2013).

Klinikai tünetek és súlyos kórtan

A klinikai tüneteket apátia és mérsékelt vagy súlyos nehézlégzés jellemezte. Egyes csirkéknél a kötőhártya kivörösödött, túlzott könnyezés és a szemhéjak és az orrmelléküregek duzzanata volt (1. ábra). Súlyos légzési tünetekkel rendelkező rétegekben fibrint és nekrotikus sárgásfehér anyagot figyeltek meg, amely elfedte a gége és a légcső nyálkahártyáját (2. ábra). Hyperemiát és a légcső nyálkahártyájának megvastagodását vékony fibrinréteggel figyelték meg az enyhe vagy mérsékelt légzési tünetekkel rendelkező csirkéknél.

Hisztopatológia

Immunhisztokémia

Az IHC-hez eljuttatott 30 madár közül 70% (20/30) pozitív jelet mutatott a gégében és a légcsőben, amelyet sárgásbarna szemcsés festés jellemzett a nyálkahártyára tapadt vagy a nyálkahártyához tapadt szinkitális sejtek citoplazmájában (5. ábra). 6). Pozitív jelet figyeltek meg a látszólag normális hámsejtekben is. A vizsgált tüdők mintegy 53% -ánál (14/26) pozitív jelzés mutatkozott a GaHV-1 iránt a hámsejtekben és a hörgők syncytiaiban. A 20 elemzett csirke turbináiban és orrmelléküregében csak 29,6% (8/27) mutatott pozitív jelet a GaHV-1-re. Az IHC-hez benyújtott csirkék a betegség akut stádiumával kompatibilis hisztopatológiai elváltozásokat mutattak.

Polimeráz láncreakció

A kötőhártyából, a turbinátokból és az orrmelléküregekből, a gégéből/légcsőből és a tüdőből kivont DNS 50% (39/78), 56% (28/50), 63,2% (31/49) és 57% (30/52) GaHV volt -1 pozitív PCR-rel. A tipikus ILT elváltozású tojótyúkok trigeminus ganglionjainak mintája PCR-rel 90% (9/10), a hátsó udvari csirkék trigeminus ganglionjainak 16% (1/6) pozitív volt. A háztáji csirkék formalinnal rögzített légcsövének mintái 25% (2/8) pozitívak voltak. A kereskedelmi célú tojótyúkok IHC-vel és PCR-rel végzett pozitív szöveti százalékos eredményeit a 2. táblázat tartalmazza.

A GaVH-1-vel fertőzött kötőhártya és légzőszövetek ennek a vizsgálatnak több csirkéjében tipikus ILT elváltozásokat mutattak be. Hasonló elváltozásokat figyelt meg Purcell (1971) három-négy nappal a csirkék GaHV-1-gyel történő kísérleti fertőzése után. Egy másik, intranazálisan beoltott alacsony virulenciájú törzzsel végzett kísérleti vizsgálatban azonban a tüdő- és légzsákelváltozások csak öt nappal az oltás után következtek be (Timurkaan et al. 2003). Hasonlóképpen, a turbinákban és az orrmelléküregekben a fertőzés után négy nappal az intranukleáris zárványtestekkel való szinkcinát figyelték meg. Kirkpatrick et al. (2006) megemlítette, hogy a GaHV-1 vírus tropizmust is mutathat a kötőhártya számára. Ebben a tanulmányban az elemzett csirkék közül többen kötőhártya-gyulladást mutattak be, de az inklúziós testekkel való syncytia kialakulását ritkábban figyelték meg, összehasonlítva a légzőszervi epitheliummal.

Bár ebben a vizsgálatban a PCR-rel értékelt minták száma az ICP4 génre és az IHC-re különbözött, a PCR láthatóan érzékenyebb volt, mint az IHC technika. Az ICP4 gén szerepet játszik a fertőzés korai genomi expressziójának szabályozásában, és epidemiológiai vizsgálatok során használják a vakcinatörzsek és a szántóföldi és a vad törzsek megkülönböztetésére (Johnson et al., 1995; Chacon és Ferreira, 2009). Az összegyűjtött szövetminták és 10% pufferolt formalinban tartották három vagy négy napig (majd feldolgozták vagy 70% -os etanolba helyezték) javították a DNS helyreállítását és a minőséget a rögzítés után. A formalinban hosszú ideig rögzített szövetek keresztkötések kialakulásához vezetnek a DNS-ben lévő biomolekulák között, ami rontja a PCR eredményeket (Gilbert et al., 2007). Ezenkívül a paraffinba ágyazás folyamata magas hőmérsékleten fragmentálja a DNS-t, ezáltal rontva a genetikai anyag minőségét. Előnyös, ha viszonylag kicsi amplifikációs termékkel rendelkező primereket alkalmazunk a formalin rögzítésével és a paraffin beágyazásával kapcsolatos problémák hatásának minimalizálása érdekében (Kleter et al., 1998). A hagyományos PCR-rel kapott eredmények, mint ebben a tanulmányban, lehetővé tették a vírus detektálását alacsonyabb költségekkel, mint az IHC és/vagy a valós idejű PCR.

A gége/légcső az ILT-re jellemző elváltozások gyakoribb előfordulását mutatta hisztopatológiai módszerekkel, de a tüdőben és az orrmelléküregekben is nagy volt az elváltozások előfordulása, amelyet kötőhártya követett. Ez azt mutatja, hogy ezek a szövetek fontosak az ILT diagnosztizálásához, és ezeket a hisztopatológiához kell összegyűjteni. Tapasztalataink szerint az összes fent említett szövet elérhetősége növeli a hisztopatológiai diagnózis felállításának esélyét. Az IHC hasznos kiegészítő eszköz a végleges ILT diagnózisra a betegség szubakut fázisában, amikor az intranukleáris zárványtestekkel rendelkező szinkitális sejtek már nem figyelhetők meg. Azonban az ICP4 génből származó specifikus primereket alkalmazó, 237 bázispárból álló terméket előállító PCR érzékenyebb volt, és nagyon hasznos a GaHV-1 gyors kimutatására csirkékben. A rögzített szövetek mind a hisztopatológiai vizsgálatot, mind a GaHV-1 PCR-rel történő kimutatását lehetővé teszik, ezért jó lehetőség azokon a területeken, ahol a gazdaságok több száz kilométerre találhatók egy diagnosztikai központtól, csökkentve a friss minták megőrzésével és a vírus terjedésének kockázatát.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a tanulmányt a "Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais" (FAPEMIG - APQ-01938-10 projektszám) finanszírozta. Ösztöndíjakat a "Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico" (CNPq) és a "Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior" (CAPES), Brazília biztosította. Hálásak vagyunk az Instituto Mineiro de Agropecuaria (IMA) állatorvosainak, Izabella Hergotnak, Luiz Antonio Torinónak és Simone G. Palmának a mintagyűjtéshez nyújtott segítségért.

Asheg AA, Tarhuni OA, Al-Garib SO, Hamid MA, Kammon AM. A fertőző laryngotracheitis kitörése réteges csirkékben Líbiában. Az Indian Veterinary Journal 2011; 88 (8): 135-6. [Linkek]

Beltrão N, Furian TQ, Leão JA, Pereira RA, Moraes L, Canal CW. 2004. Detecção do vírus da laringotraqueíte das galinhas no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 2004; 24 (2): 85-8. [Linkek]

Calnek BW, Fahey KJ, Bagust TJ. In vitro fertőző vizsgálatok fertőző laryngotracheitis vírussal. Madárbetegségek 1986; 30 (2): 327-36. [Linkek]

Chacón JLV, Ferreira AJP. A fertőző laryngotracheitis vírus terepi izolátumainak és vakcinatörzseinek differenciálása DNS-szekvenálással. Vakcina 2009; 27 (48): 6731-38. [Linkek]

Chacón JLV, Brandão PEB, Villarreal LYB, Gama NM, Ferreira AJP. A fertőző laryngotracheitis kitörésének felmérése a tojótyúkokban és a differenciáldiagnózis más légúti kórokozókkal. Revista Brasileira de Ciência Avícola 2007; 9 (1): 61-7. [Linkek]

Cowdry EV. Az intranukleáris zárványok problémája vírusbetegségekben. Patológiai Levéltár 1934; 18: 527-42. [Linkek]

Crawshaw GJ, bojkott BR. Fertőző laryngotracheitis pávákban és fácánokban. Madárbetegségek 1982; 26 (2): 397-401. [Linkek]

Crespo R, Woolcock PR, Chin RP, Shivaprasad HL, García M. A diagnosztikai technikák összehasonlítása húscsirkék fertőző laryngotracheitisének kitörésekor. Madárbetegségek 2007; 51 (4): 858-62. [Linkek]

Fuchs W, Veits J, Helferich D, Granzow H, Teifke JP, Mettenleiter TC. A madárfertőző laryngotracheitis vírus molekuláris biológiája. Állatorvos-kutatás 2007; 38 (2): 261-79. [Linkek]

Gilbert MTP, Haselkorn T, Bunce M, Sanchez JJ, Lucas SB, Jewells LD, Marcks EV. Nukleinsavak izolálása rögzített, paraffinba ágyazott szövetekből - mely módszerek mikor alkalmazhatók? PLoS One 2007; 2: 1–12. [Linkek]

Guy JS, Garcia M. Laryngotracheitis. In: Saif YM, Barnes HJ, Glisson JR, Fadly AM, McDougald LR, Swayne DE, szerkesztők. A baromfi betegségei. 12. kiadás Ames: Iowa State Press; 2008. p.121-134. [Linkek]

Hayashi S, Odagiri Y, Kotani T, Horiuchi T. A légcső nyálkahártyájának patológiás változásai fertőző laryngotracheitis vírussal fertőzött csirkékben. Madárbetegségek 1985; 29 (4): 943-50. [Linkek]

Herschke F, Plumet S, Duhen T, Azocar O, Druelle J, Laine D, Wild TF, Rabourdin-Combe C, Gerlier D, Valentin H. A kanyaró vírus által kiváltott sejt-sejtfúzió felerősíti az I típusú interferon választ. Journal of Virology 2007; 81 (23): 12859-71. [Linkek]

Hipólito O, Soares LA, Pereira OAC, Pinto AA, Bottino JA. 1974. Isolamento e identificação do vírus da laringotraqueite infecciosa das galinhas no Brasil. Anais do Congresso Brasileiro de Microbiologia; 1974; Rio de Janeiro, RJ. Brasil. 16. o. [Linkek]

Hughes CS, Williams RA, Gaskell RM. A fertőző laryngotracheitis vakcina vírus látenciája és reaktivációja. Virológiai archívumok 199; 121 (1-4): 213-18. [Linkek]

Johnson MA, Tyack SG, Prideaux C, Kongsuwan K, Sheppard M. fertőző laryngotracheitis vírus (gallid herpesvirus- 1) ICP4 gén nukleotidszekvenciája. Víruskutatás 1995; 35 (2): 193-204. [Linkek]

Kernohan G. Fertőző laryngotracheitis szárnyasokban. Journal American of Veterinary Medical Association 1931; 78: 196-202. [Linkek]

Kirkpatrick NC, Mahmoudian A, Colson CA, Devlin JM, Noormohammadi AH. Kapcsolat a mortalitás, a klinikai tünetek és a légcső patológiája között a fertőző laryngotracheitisben. Madárpatológia 2006; 35 (6): 449-53. [Linkek]

Kleter B, Doorn LJ, Schegget J, Schrauwen L, Krimpen K, Burger M, Harmsel B, Quint W. Novel Short-Fragment PCR assay az anogenitális humán papillomavírusok nagyon érzékeny széles spektrumú detektálására. American Journal of Pathology 1998; 153 (6): 1731-39. [Linkek]

Luna LG. A Fegyveres Erők Patológiai Intézetének szövettani festési módszereinek kézikönyve. 3. kiadás New York: McGraw-Hill könyv; 1968. 32–46. [Linkek]

Oldoni I, Rodríguez-Avila A, Riblet SM, Zavala G, García M. Az Egyesült Államokból származó kiválasztott fertőző laryngotracheitis vírustörzsek patogenitási és növekedési jellemzői. Madárpatológia 2009; 38 (1): 47-53. [Linkek]

Portz C, Beltrão N, Furian TQ, Macagnan M, Griebeler J, Rosa CAVL, Colodel EM, Driemeier D, Back A, Schatzmayr OMB, Canal CW. A pulykák természetes fertőzése fertőző laryngotracheitis vírussal. Veterinary Microbiology 2008; 131 (1-2): 57-64. [Linkek]

Preis IS, Braga JFV, Couto RM, Brasil BSAF., Martins NRS, Ecco R. A fertőző laryngotracheitis kitörése nagy, több korú tojásrétegű csirkeállományokban Minas Gerais-ban, Brazíliában. Pesquisa Veterinária Brasileira 2013; 33 (5): 591-96. [Linkek]

Purcell DA. A fertőző laryngotracheitis kórszövete aeroszollal fertőzött szárnyasoknál. Journal of Comparative Pathology 197; 81 (3): 421-31. [Linkek]

Reynolds HA, Watrach, AM, Hanson LE. A fertőző laryngotracheitis nukleáris inklúziós testeinek fejlődése. Madárbetegségek 1968; 12 (2): 332-47. [Linkek]

Tadese T, Potter E, Fitzgerald S, Reed WM. Csirkék egyidejű fertőzése madárhimlő vírussal és fertőző laryngotracheitis vírussal immunhisztokémiai módszerrel és multiplex polimeráz láncreakciós technikával kimutatva. Madárbetegségek 2007; 51 (3): 719-24. [Linkek]

Timurkaan N, Yilmaz F, Bulut H, Ozer H, Bolat Y. Patológiai és immunhisztokémiai leletek a fertőző laryngotracheitis vírus alacsony virulens törzsével beoltott brojlereknél. Journal of Veterinary Science 2003; 4 (2): 175-180. [Linkek]

Wang LG, Ma J, Xue CY, Wang W, Guo C, Chen F, Qin JP, Huang NH, Bi YZ, Cao YC. A fertőző laryngotracheitis vírus dinamikus eloszlása és szöveti tropizmusa kísérletileg fertőzött csirkékben. Virológiai archívumok 2013; 158 (3): 659-66. [Linkek]

Williams RA, Bennett M, Bradbury JM. 1992. A fertőző laryngotracheitis vírus látens helyeinek bemutatása a polimeráz láncreakció segítségével. Journal of General Virology 1992; 73 (9): 2415-20. [Linkek]

Winterfield RW, tehát IG. A pulykák fogékonysága a fertőző laryngotracheitisre. Madárbetegségek 1968; 12 (1): 191-202. [Linkek]

Levelezés:
Mineral Gerais Szövetségi Egyetem
Escola de Veterinária
Av. Antônio Carlos 6627
Belo Horizonte, MG 30123-970, Brazília
E-mail: [email protected], [email protected]

Beküldve: 2013. november
Jóváhagyva: 2014. június

A napló minden tartalmát, kivéve, ha másként jelezzük, a Creative Commons Nevezési Licenc alapján licenceljük