A mezenhimális stromális sejtek szekretomeja megakadályozza a miofibroblasztok differenciálódását azáltal, hogy fibrózissal társult mikroRNS-eket visz át az extracelluláris vezikulákban

A mezenhimális ős/sztrómasejtek kondicionált táptalaj (MSC-CM) frakciói, a transzformáló növekedési faktor-béta (TGFbeta) egyidejű hozzáadásával megakadályozták a fibroblasztok TGFbeta-indukálta aSMA expressziójának növekedését. ASMA expresszió elemzése szérummentes tenyésztett kontroll fibroblasztokban (- TGFbeta), fibroblasztokban TGFbeta (+ TGFbeta) és TGFbeta expozíció után az MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF) komponenseivel . (A) RT-PCR (n = 9). (B) Western-blot (n = 3).

A TGFbeta-val egyidejűleg hozzáadott MSC-CM-frakciók megakadályozták a TGFbeta által indukált aSMA-redisztribúciót a fibroblasztok stresszrostjaiba. Immunfluoreszcens elemzés (aSMA (zöld), phalloidin (piros), DAPI (kék)) az aSMA tartalmának szérummentes tenyésztett kontroll fibroblasztokban (- TGFbeta), fibroblasztokban TGFbeta (+ TGFbeta) és TGFbeta expozíció után MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF). Méretarány: 100 μm.

A TGFbeta-val egyidejűleg hozzáadott MSC-CM-frakciók megakadályozták a vinculin TGFbeta-indukálta intracelluláris újraeloszlását a perinukleáris zónából a fibroblasztok gócos adhéziós kontakthelyeihez. A szérummentes tenyésztett kontroll fibroblasztokban (- TGFbeta), fibroblasztokban a TGFbeta (+ TGFbeta) és a TGFbeta expozíció után a vinculin tartalmának immunfluoreszcens analízise (vinculin (zöld), phalloidin (piros), DAPI (kék)) MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF). Méretarány: 100 μm.

A TGFbeta-val egyidejűleg hozzáadott MSC-CM-frakciók megakadályozták a kezelt fibroblasztok I. típusú kollagéntermelésének és kontraktilis aktivitásának TGFbeta-indukálta növekedését. Változások a szérummentes tenyésztett kontroll fibroblasztok (- TGFbeta), fibroblasztok TGFbeta (+ TGFbeta) és TGFbeta expozíció után az MSC-CM (+ TGFbeta + MSC-EV; + TGFbeta + MSC-SF) komponenseivel . (A) RT-PCR az I. típusú kollagénen (n = 9). (B) Kollagén összehúzódási vizsgálat (n = 3) B.1. B.2 Makró fotók.

A TGFbeta-val egyidejűleg hozzáadott humán dermális fibroblasztok kondicionált táptalaj (HDF-CM) frakciói nem voltak képesek megakadályozni a TGFbeta által indukált aSMA stressz szálakba történő újraeloszlását és a fibroblasztok kontraktilis aktivitását. Az aSMA expressziója szérummentes tenyésztett kontroll fibroblasztokban (- TGFbeta), fibroblasztokban TGFbeta (+ TGFbeta) és TGFbeta expozíció után a HDF-CM (+ TGFbeta + HDF-EV; + TGFbeta + HDF-SF) komponenseivel ). (A) Immunfluoreszcens elemzés (aSMA (zöld), falloidin (piros), DAPI (kék)). Méretarány: 100 μm. (B) Kollagén összehúzódási vizsgálat.

A TGFbeta-kezelés után hozzáadott MSC-CM-frakciók megfordították a fibroblasztok TGFbeta-indukálta aSMA expressziójának növekedését és annak stresszrostokká történő újraelosztását. Az aSMA expresszió elemzése a fibroblasztokban TGFbeta (+ TGFbeta) expozíció után, majd a tenyészközeg ezt követő cseréje az MSC-CM komponenseivel (+ TGFbeta -> MSC-EV; + TGFbeta -> MSC-SF) vagy kontroll szérum- szabad DMEM (+ TGFb -> DMEM). (A) Immunfluoreszcencia elemzés (aSMA (zöld), phalloidin (piros), DAPI (kék)). Méretarány: 100 μm. (B) Western-blotolás. * p DMEM csoport).

A TGFbeta-kezelés után hozzáadott MSC-CM-frakciók megfordították a fibroblasztok TGFbeta-stimulált kontraktilis aktivitását. A fibroblasztok funkcionális aktivitásának változásai a TGFbeta (+ TGFbeta) expozíció és a növekedési közeg ezt követő cseréje után az MSC-CM komponenseivel (+ TGFbeta -> MSC-EV; + TGFbeta -> MSC-SF) vagy kontroll szérummal -mentes DMEM (+ TGFbeta -> DMEM). Kollagén összehúzódási vizsgálat. * p DMEM csoport).

A mezenhimális stromális sejtből (MSC) felszabaduló extracelluláris vezikulák (EV) jellemzése 48 órás kondicionálás után. (A, B) Az EV-készítmények részecskeméret-eloszlása (piros) és az MSC-CM kontroll aliquotjai 30 perc kondicionálás után (szürke) nem tömény (A) és ötszörös koncentrációjú (B) minták esetében nanorészecskék követési elemzésével mérve (NTA). (C) MSC-EV képalkotás transzmissziós elektronmikroszkóppal (az EV-ket nyilak jelzik).

Az RNS-profil elemzése MSC-EV-ben RNS-szekvenciával. (A) Különböző típusú RNS-ek vannak jelen az MSC-EV-ben. A vörös oválissal jelölt mikroRNS-klaszter. (B) A mikroRNS reprezentációjának változékonysága a donor zsírszövetből származó MSC-EV-ben Venn-diagramokkal. (C) A leggyakoribb mikroRNS az MSC-EV-ben (top-10). (D) Fibrózishoz kapcsolódó mikroRNS reprezentáció MSC-EV-ben az előre jelzett géncél-elemzésük alapján.

A kiválasztott mikroRNS-ek (miR-21 és miR-29c) antagomiR-ek általi gátlása gyengíti az EV által közvetített MSC képességét, hogy megakadályozza a fibroblasztok TGFbeta által indukált differenciálódását myofibroblastokká, az I. típusú kollagén termelés (A) és az aSMA expresszió (B), Western blot ( n = 3). EV: MSC-EV transzfekció nélkül, IC: gátló kontroll oligókkal transzfektált MSC-EV (anti-miR-ek kontrollja). anti-miR-21: anti-miR-21-vel transzfektált MSC-EV, anti-miR-29: anti-miR-29-vel transzfektált MSC-EV * p C) A miR-21 és miR-29c közös célpontjai a MirNet segítségével jósoltak szolgáltatás. (D) Az MSC-EV által átvitt miR-21 hatása a fibroblasztokban kiválasztott pro-fibrotikus célok szabályozására, Western-blottolással értékelve (n = 1).

Absztrakt

1. Bemutatkozás

2. Anyagok és módszerek

2.1. Sejtkultúra

2.2. Kondicionált közepes betakarítás és frakcionálás

2 × 103 sejt/cm2). 90–100% összefolyásnál a sejteket háromszor Hanks pufferoldattal (Paneco) mostuk. Ezután az edényeket 48 órán át inkubáltuk 10 ml DMEM LG-vel 37 ° C-on, 5% CO2-nál. Sejt nélküli DMEM LG-t használtunk negatív kontrollként (DMEM). 48 óra múlva a táptalajt eltávolítottuk, és 10 percig centrifugáltuk 300xg-vel a sejttörmelék eltávolítása érdekében. Az MSC-CM-t Minim ™ II Tangential Flow Filtration System-re koncentráltuk, 10 kDa-os szűrőkön (Pall Corporation, Port Washington, NY, USA), majd áttettük egy Amicon-szűrőbe (1000 kDa, Sigma, Milánó, Olaszország), és centrifugáltuk különálló sejten kívüli vezikulák (MSC-EV) frakció az MSC-CM (MSC-SF) EV-mentes frakciójából. Mindkét frakciót ötször töményítettük. Az összes mintát -80 ° C-on tároltuk. Az átlagos sejtszám az MSC-CM eltávolítása után 6,8 × 105 sejt volt.