Elhízás elleni hatása Solidago virgaaurea kivonat nagy zsírtartalmú étrenddel táplált SD patkányokban

MOLEKULÁRIS ÉS SEJTBIOLÓGIA

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Engedélyezés
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

ABSZTRAKT

Bevezetés

Az elhízás az étvágyszabályozás és az energiacsere összetett rendellenessége, és az utóbbi években az egyik legelterjedtebb anyagcserezavar lett (Nguyen & El-Serag 2010; Sharma & Padwal 2010). Köztudott, hogy a diabetes mellitus, a szív- és érrendszeri betegségek, agyvérzés és a rák kialakulásához kapcsolódik (Cope & Allison 2008; Guo és mtsai 2009; Dixon 2010). Az elhízás és szövődményei világszerte problémává váltak a magas költségek kezelésével. Ezért egyre nagyobb erőfeszítéseket tettek az elhízás megelőzésére szolgáló gyógyászati és fitokémiai források alternatív orvoslásának fejlesztésére (Finkelstein és mtsai 2008; Park és mtsai 2009; Cawley és Meyerhoefer 2011).

Az elhízás kezelésére szolgáló gyógyszerek lehetséges célpontjaként számos, a lipid anyagcserében részt vevő jelátviteli utat és kapcsolódó géneket vizsgáltak (Reilly & Lee 2008). Közülük az AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) az energia-, glükóz- és lipid-metabolizmus kulcsfontosságú szabályozója. Mély hatást gyakorol a lipid oxidációra, szintézisre és tárolásra (Zhou és mtsai 2001; Niu és mtsai 2012). Az AMPK-aktiváció a downstream szubsztrátok, beleértve a zsírsav-szintetázt (FAS), a c-AMP válaszelem-kötő fehérjét (CREB) és az acetil-CoA karboxilázt (ACC), foszforilezésével befolyásolja a lipid anyagcserét. A treonin (Thr-172) foszforilezését az AMPK alfa-alegységén e kináz aktivációs indexének tekintik. Az AMPK aktivációja gátolja az ACC-t a foszforiláció révén, amely kritikus enzim a zsírsavak bioszintézisének és oxidációjának szabályozásában. Az AMPK-t az elhízás és az elhízással összefüggő anyagcserezavarok, például a hiperlipidémia fő terápiás célpontjaként javasolták (Iglesias et al. 2004).

A különféle polifenolok (Wang és mtsai 2014) és más kivonatok (Kang és mtsai 2012) elhízásellenes hatást mutattak ki a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízásban egerekben és patkányokban. Solidago virgaaurea var. gigantea (SV) MIQ. Az évelő gyógynövény (Compositae) Dél-Koreában széles körben elterjedt, és különösen kulináris zöldségként termesztik az Ullung-szigeten. Ezt a növényt gyomor- és vízhajtóként használták a koreai népi orvoslásban (Lee 1979). Korábbi fitokémiai vizsgálatok kimutatták az eritrodiol-3-acetát, a c-tokoferol-kinon, a transz-fitol és a 2-metoxi-benzil-2,6-dimetoxi-benzoát jelenlétét a növény hexánban oldódó frakciójában (Sang et al. 2004) . Megvizsgálták az SV légi részeiből nyert metanol-kivonat kémiai összetevőit is (Lee 2004). Korábbi vizsgálatunkban megfigyelték, hogy az SV etanol-kivonat jelentősen gátolja az adipogenezist a 3T3-L1 adipocita sejtekben (Jang et al. 2016).

Ebben a vizsgálatban az SV etanol-kivonatának elhízásellenes hatását HDF-vel táplált Sprague-Dawley (SD) patkányon tesztelték. Az SD patkányok orális kezelése SV kivonattal csökkentette a testtömeget, a zsírszövet súlyát, a vér alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterin szintjét, a vér trigliceridek (TG) szintjét és a máj zsírsav szintjét, ami arra utal, hogy az SV kiváló elhízás elleni hatással rendelkezik kivonat a HFD okozta elhízás ellen.

Anyagok és metódusok

Növényi anyagok

Az SV-t Ulreung-szigeten, a Koreai Köztársaság déli részén lévő Mezőgazdasági Technológiai Központtól szállították. Az utalványmintát (RIC-2000-10) letétbe helyezték a Funkcionális Élelmiszerek és Kábítószerek Hatékonyságértékelésének és Fejlesztésének Központjában, a Hallym Egyetemen, Chuncheonban. A mintákat HJ Chi emeritus professzor hitelesítette, a Koreai Köztársaság (Dél) Szöuli Nemzeti Egyetem.

SV kivonat készítése

1,5 kg SV száraz szárított légi részét szobahőmérsékleten 48 órán át 15% 10% etanollal extraháltuk. A kapott kivonatot rotációs vákuumban bepároljuk és fagyasztva szárítjuk. Az SV kivonat porját -20 ° C-on tároltuk.

Kémiai vegyületek azonosítása az SV kivonatban

A 10% -os etanolos SV extraktumot desztillált vízben szuszpendáljuk, majd etil-acetáttal (EtOAc) és etil-acetáttal kirázzuk n-butanol (n-BuOH) 16,75 g EtOAc-frakciót kapunk, an n-BuOH-frakció (26 g) és víz-frakció (25 g). Az aktív n-A BuOH frakciót 20%, 40%, 60%, 80% és 100% metanollal rendelkező Diaion HP-20 gyanta felhasználásával szubfrakcionáljuk, és öt frakciót kapunk: 1. frakciót (6,6 g), 2. frakciót (2,1 g), 3. frakciót (3,7 g), a 4. frakció (3,8 g) és az 5. frakció (1,5 g). Végül a protokétusav (1. csúcs, Gerothanassis et al. 1998), a klorogénsav (2. csúcs, Jin és mtsai. 2005), 3,5-di-O-koffein-kininsav (4. csúcs, Choi és mtsai. 2004), 1,3,5-tri-O-koffein-kininsav (6. csúcs, Agata és mtsai. 1993) és kaemferol-3-O-rutinosidot (8. csúcs, Choi és mtsai. 2004) izoláltunk és a 3. és az 5. frakcióból aktív komponensként azonosítottunk Sephadex LH-20-val 50% MeOH-val, az olaj vörös O festésével 3T3-L1 sejtekben (Jang et al. 2016 ) (1.ábra). És további négy ismeretlen vegyületet (3., 5., 7. és 9. csúcs) izoláltunk a 2. és 4. frakcióból. Szerkezetüket részben fahéjhoz kapcsolódó vegyületként határozták meg EI-MS, UV, IR, 1 H és 13 C -NMR.

Online közzététel:

1. ábra: SV kivonat Hplc kromatogramja 254 nm-en. Számos komponenst detektáltunk az SV kivonat kromatogramján HPLC analízissel.

1H-NMR-alapú máj metabolomika

Az NMR-alapú máj metabolomikát, beleértve a májszövet előkészítését, a pulzus megszerzését és a metabolitok azonosítását, valamint az adatfeldolgozást a korábbi jelentések szerint, kisebb módosításokkal végeztük (Athina et al. 2013). Azokat a lipofil extraktumokat, amelyek a máj legtöbb lipid alkotórészét tartalmazták, felhasználtuk 1H-NMR spektroszkópiához. A májszövetet (100 mg) 1 ml CHCl3/CH30H-ban (3: 1, v/v) homogenizáltuk, majd 10 000 fordulat/perc sebességgel 4 ° C-on 10 percig végzett centrifugálás után a felülúszót összegyűjtöttük és nitrogénáramban fagyasztva szárítottuk. . A lipidkivonatot 665 µl deuterált kloroform/metanol (CDCI3/CD3OD, 3: 1) oldattal állítottuk elő.

HPLC elemzés

Az elemzést Agilent Eclipse plus C18 oszlop segítségével végeztük, 4,6x150 mm, 30 ° C-on, az előző jelentésben leírtak szerint (Heo et al. 2016). A mobil fázis 0,1% TFA és MeOH gradiens volt 0,7 ml/perc 40% B áramlási sebességgel 0-15 percig, lineáris növekedés 40% -ról 60% B-re 15-30 percig, 100% B 30–40 perc, ugyanez a% 40–50 percig, lineáris csökkenés 100% -ról 5% B-re 50–55 percig és ugyanaz a% B 55–60 percig. A csúcsokat 254 nm hullámhosszon detektáltuk. A minta injekciós térfogata 10 µl volt metanolos oldatban.

Állatok és kísérleti tervezés

A szérum biokémiai paramétereinek elemzése

A szérumot centrifugálással azonnal elválasztottuk (2000x g 4 ° C-on 3 percig) és -70 ° C-on tároljuk. Az aszpartát-aminotranszferáz (AST), az alanin-aminotranszferáz (ALT), a kreatinin (CREA), a vér vizelet-nitrogénje (BUN), a TG, az LDL és a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) szérumkoncentrációit kereskedelmi készletekkel (971769, 981771 és 971656) elemezték. illetve a Thermo Electron Co., Vantaa, Finnország) és a Thermo Fisher Konelab 20XTi Analyzer (Thermo Electron Corporation, Seo Kwang LaboTech, Szöul, Korea).

Western blot elemzés

Az epididimális zsírszöveteket lízispufferben (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM etilén-diamin-tetra-ecetsav (EDTA), 10% glicerin és 1% Nonidet P40 (NP4), 0,1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid ( PMSF), 10 μg/ml, minden leupeptin, aprotinin és pepstatin A). 80 mikrogramm fehérjét elválasztottunk nátrium-dodecil-szulfát (SDS) -poliakrilamid gélen, és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra vittük. A membránokat primer antitestekkel, majd torma-peroxidázzal konjugált szekunder antitestekkel inkubáltuk, az előző jelentésben leírtak szerint (Heo és mtsai. 2010). A kapott sávokat fokozott kemilumineszcencia (ECL) rendszerrel (Amersham Biosciences) tették láthatóvá a gyártó eljárása szerint. Az ebben a munkában alkalmazott primer antitestek az anti-AMPK, az anti-pAMPK (Thr 172), az anti-CREB, az anti-ACC, az anti-FAS, az anti-FABP4 (Cell Signaling Technology, USA) és az anti-aktin (Sigma, USA) ).

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést hallgató végezte t-tesztelje a GraphPad Prism 4.0 verzióját Windows rendszerhez (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). o-A 0,05-nél kisebb értékeket tekintettük statisztikai szignifikancia jelzésére. Valamennyi értéket átlag ± S.E.M. Legalább négy különböző kísérletet hajtottunk végre, és a kísérletek eredményeinek statisztikai elemzését végeztük.

Eredmények

Kémiai vegyületek azonosítása az SV kivonatban

Számos csúcsot detektáltunk az SV kivonat kromatogramján HPLC analízissel (1. ábra). Ezért a 10% -os etanolos SV extraktumot desztillált vízben szuszpendáljuk és EtOAc és n-BuOH. Ben nyert SV kivonat n-A BuOH-t öt frakcióra osztottuk Diaion HP-20 oszlopkromatográfiával. Végül öt vegyületet izoláltunk, és a 3. és az 5. frakcióból azonosítottuk aktív hatóanyagként a Sephadex LH-20-ot 50% MeOH-val, olaj Red O-festéssel 3T3-L1 sejtekben (Jang et al. 2016). Ezenkívül további négy ismeretlen vegyületet (3., 5., 7. és 9. csúcs) izoláltunk a 2. és 4. frakcióból. Szerkezetüket részben fahéjsavval rokon vegyületként határozták meg EI-MS, UV, IR, 1 H, és 13C-NMR analízis (1. ábra).

Az SV kivonat hatása a test és a szövet súlyára

SD patkányokat kezeltünk Garcinia gummi-gutta (G) kivonat, jól ismert elhízás elleni növényi kivonat pozitív kontrollként 500 mg/kg/nap koncentrációban, és SV-kivonat („S” jelöléssel ellátva) 100, 500 és 1000 mg/kg/nap koncentrációban. A testtömeget hetente mértük a nyolc hetes kísérleti időszak alatt. A testtömeg öt hét múlva kezdett növekedni, miután a HFD-vel táplált SD patkányokat SV kivonattal kezelték a kontroll étrendhez képest (2. ábra (a)). Az SV kivonat a kezelés után két héttel csökkentette a testsúlyát, és a testtömeg figyelemre méltó csökkenését mutatta a kezelés koncentrációjával arányosan, míg a G kivonat alacsony testtömeg csökkenést mutatott a HFD-vel táplált SD patkányokkal szemben. Összességében a 100 mg/kg SV-kivonat majdnem ugyanolyan hatékonyságot mutatott a testtömeg csökkentésében az 500 mg/kg G-kivonattal. A zsírszövet súlya szintén jelentősen csökkent az SV-kivonattal végzett kezeléssel (2. ábra (b)), összehasonlítva a G-kivonattal. A vese és a szív súlya nem változott, de a máj súlya enyhe csökkenést mutatott az SV és G kivonatokkal végzett kezeléssel, ami azt jelzi, hogy a máj szövet a lipidek lerakódásához. Ez az eredmény azt jelzi, hogy az SV kivonat kiváló csökkentő aktivitással rendelkezik a HFD-vel táplált SD patkányok test- és zsírszövet-tömegében.

Online közzététel:

2. ábra Az SV kivonattal kezelt HFD-vel táplált SD patkányok testtömegének és végső szervtömegének változásai. Az SV kivonattal kezelt HFD-vel táplált SD patkányok testtömegét minden héten megmértük 8 kísérleti héten keresztül. A szervek súlyát a kísérlet utolsó hetében mértük. A zsír tömegét a periepididymális zsírszövet tömegének meghatározásával mértük. A „Con” a normál táplálékkal táplált SD patkányt jelöli. A „Con-fat” a HFD-vel táplált kontrollt jelenti. A „G500” azt jelzi, hogy 500 mg/kg garcinia-kivonattal kezelték. Az „S100”, „S500” és „S1000” 100, 500, 1000 mg/kg SV kivonattal kezelt. *o 2. ábra Az SV kivonattal kezelt HFD-vel táplált SD patkányok testtömegének és végső szervtömegének változásai. Az SV kivonattal kezelt HFD-vel táplált SD patkányok testtömegét minden héten megmértük 8 hét kísérleti időtartam alatt. A szervek súlyát a kísérlet utolsó hetében mértük. A zsír tömegét a periepididymális zsírszövet tömegének meghatározásával határoztuk meg. A „Con” a normál táplálékkal táplált SD patkányt jelöli. A „Con-fat” a HFD-vel táplált kontrollt jelenti. A „G500” azt jelzi, hogy 500 mg/kg garcinia-kivonattal kezelték. Az „S100”, „S500” és „S1000” 100, 500, 1000 mg/kg SV kivonattal kezelt. *o Elhízás elleni hatása Solidago virgaaurea kivonat nagy zsírtartalmú étrenddel táplált SD patkányokban

Online közzététel:

3. ábra: Különböző kezelésekkel kezelt HFD-vel táplált SD patkányok vér koleszterinszintje, TG (triacil-glicerin), AST, ALT, CREA és BUN szintje. Véreket gyűjtöttünk HFD-vel táplált SD patkányoktól, amelyeket 8 héten át kezeltünk különféle kezelésekkel, és szérumokat készítettünk. Az AST-t, az ALT-t, a koleszterint, a TG-t, a CREA-t és a BUN-t az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint elemeztük. A „Con” a normál táplálékkal táplált SD patkányt jelöli. A „Con-fat” a HFD-vel táplált kontrollt jelenti. A „G500” azt jelzi, hogy 500 mg/kg garcinia-kivonattal kezelték. Az „S100”, „S500” és „S1000” 100, 500, 1000 mg/kg SV kivonattal kezelt. *o 3. ábra: Különböző kezelésekkel kezelt HFD-vel táplált SD patkányok vér koleszterinszintje, TG (triacil-glicerin), AST, ALT, CREA és BUN szintje. Véreket gyűjtöttünk HFD-vel táplált SD patkányoktól, amelyeket 8 héten át kezeltünk különféle kezelésekkel, és szérumokat készítettünk. Az AST-t, az ALT-t, a koleszterint, a TG-t, a CREA-t és a BUN-t az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint elemeztük. A „Con” a normál táplálékkal táplált SD patkányt jelöli. A „Con-fat” a HFD-vel táplált kontrollt jelenti. A „G500” azt jelzi, hogy 500 mg/kg garcinia-kivonattal kezelték. Az „S100”, „S500” és „S1000” 100, 500, 1000 mg/kg SV kivonattal kezelt. *o 1 H-NMR májkivonat spektroszkópia

A lipidben oldódó májkivonat H-NMR spektrumai alacsony molekulatömegű metabolitok jeleit mutatták. A kloroform – metanol májkivonatok spektrumát a különféle lipidrészek, köztük a koleszterin, a poli- és egyszeresen telítetlen zsírsavak (PUFA és MUFA), a TG és a foszfolipid szignáljai dominálták. Az SV-kivonatokkal vagy G-kivonatokkal kezelt SD patkányok májkivonatának lipid metabolit-koncentrációját a kontrollhoz viszonyítva az 1. táblázat foglalja össze. A patkány máj 1H-NMR spektrumai csökkent lipid metabolit koncentrációt mutattak a G kivonat csoportban. mint a kontroll HFD csoport. Az SV kivonat csoport sokkal nagyobb mértékben csökkentette a lipid metabolitok koncentrációját, mint a G kivonat csoport, ami azt jelzi, hogy az SV kivonatnak magasabb a zsírsav oxidációs aktivitása a májban, mint a G kivonatnál (1. táblázat).

Online közzététel:

1. táblázat: 1H-NMR kémiai elmozdulás az endogén lipidben oldódó májkivonat metabolitjaiban.

Az SV kivonat növelte az AMPK és a p-AMPK fehérjék szintjét a zsírszövetben

Mivel az AMPK a lipid- és szénhidrát-metabolizmus egyik legfontosabb szabályozója, az AMPK, a p-AMPK és a célgén fehérje szintjét az SV kivonattal kezelt SD patkány epididimális zsírszövetében vizsgálták. Az AMPK és a p-AMPK fehérje szintje megnőtt az SV kivonattal kezelt SD patkány epididimális zsírszövetében, míg az AMPK célfehérjék, a CREB és az ACC fehérje szintje csökkent. A FAS és a lipogenezissel összefüggő FABP4 fehérjeszintje szintén a várakozásoknak megfelelően csökkent (4. ábra). Mivel az AMPK-aktivációról beszámoltak arról, hogy a downstream szubsztrátok, köztük a CREB és az ACC foszforilezésével csökkenti a lipid bioszintézist, úgy tűnik, hogy a zsírszövetben az AMPK-aktiváció az SV-kivonat elhízás elleni aktivitásának közvetlen mechanizmusa. Úgy tűnik azonban, hogy a G kivonat az elhízás elleni aktivitás más mechanizmusát követi, ahol az AMPK nem vesz részt, mivel az AMPK nem volt aktiválva.

Online közzététel:

Az epididymális zsírszövet mutatta a legkiemelkedőbb súlycsökkenést az SV-kivonattal kezelt SD patkányok szövetei között (2. ábra (b)). Az SV kivonattal kezelt SD patkány epididymális zsírszövetének molekuláris elemzése kimutatta az AMPK aktivációjának szerepét (4. ábra). A zsírsav-oxidációban szintén szerepet játszó AMPK-célfehérjéket, az ACC-t és a CREB-t szintén inaktiválták (4. ábra). Beszámoltak arról, hogy az ACC AMPK-foszforilezéssel történő gátlása csökkenti a malonil-CoA-t azáltal, hogy enyhíti a karnitin-acil-transzferáz gátlását, és lehetővé teszi a zsíros acil-CoA bejutását a mitokondriális mátrixba, ahol oxidáció történik, és így az ACC-foszforilezés aktiválja a zsírsav-oxidációt. A FAS-ot, az AMPK másik célfehérjét, foszforilezéssel inaktiválja az AMPK (Daval et al. 2006; Hardie 2008). Ezért az AMPK aktiválása önmagában elegendő az adipogenezis, a lipid bioszintézis és a zsírszövetben felhalmozódó lipidek gátlásához, valamint a májban és az izmokban a zsírsav oxidációjának aktiválásához. Az SVP kivonat aktiválási mechanizmusa azonban még nem ismert. Az AMPK aktiválásának részletes mechanizmusának további jellemzése az SV kivonattal vagy annak összetevőivel helyes választ ad.

A lipidben oldódó májkivonatok alacsony molekulatömegű metabolitokat mértek 1H-NMR-vizsgálattal. A „Con” a normál táplálékkal táplált SD patkányt jelöli. A „Con-fat” a HFD-vel táplált kontrollt jelenti. A „G500” azt jelzi, hogy 500 mg/kg garcinia-kivonattal kezelték. Az „S100”, „S500” és „S1000” 100, 500 és 1000 mg/kg SV kivonattal kezelt.

Közzétételi nyilatkozat

Potenciális összeférhetetlenségről a szerzők nem számoltak be.