A tirozol jótékony hatása a megváltozott glikoprotein-összetevőkre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban

Eredeti cikk

  • Teljes cikk
  • Ábrák és adatok
  • Hivatkozások
  • Kiegészítő
  • Idézetek
  • Metrikák
  • Engedélyezés
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • PDF

Absztrakt

Kontextus: Az olívaolaj a tirozol fő forrása, amely természetes fenolos antioxidáns. Az olívaolaj a mediterrán étrend egyik fő alkotóeleme, amely a krónikus betegségek csökkent előfordulásához kapcsolódik.

jótékony

Célkitűzés: Ez a tanulmány értékeli a tirozol hatásait a megváltozott glikoprotein komponensekre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban.

Anyagok és metódusok: A cukorbetegséget hím Wistar patkányokban sztreptozotocin (40 mg/testtömeg kg) indukálta. Ezeknek a patkányoknak tirozolt (20 mg/testtömeg-kg) és glibenklamidot (600 μg/testtömeg-kg) adtak be orálisan naponta, 45 napig. Elemezték a plazma glükózt, a plazma inzulint, a glikoprotein komponenseket, például a hexózt, a hexozamint, a sziálsavat és a fukózt a plazmában, a májban és a vesében, valamint elemezték a szövetek hisztopathiáját.

Eredmények: A cukorbeteg patkányok jelentős (o 2013). Ennek a növekedésnek a legnagyobb része várhatóan a fejlődő országokban fog bekövetkezni, a legnagyobb abszolút növekedés pedig Indiában várható. Az IDF (2013) szerint Indiában 65,1 millió embernél volt DM 2013-ban. A DM-t a megnövekedett vércukorszint jellemzi az inzulinjelzés megszakadása következtében, ami inzulinhiányhoz vezet az inzulintermelő β- sejtek az 1-es típusú DM esetén, vagy inzulinrezisztencia és csökkenő β-sejtfunkció a 2-es típusú DM-ben. A 2-es típusú DM globálisan az összes DM-eset több mint 90–95% -át teszi ki. Beszámoltak arról, hogy a nem kontrollált krónikus hiperglikémia tartós kitettsége DM-ben a glükóz, a lipidek, a fehérjék és a glikoprotein-összetevők metabolizmusának károsodásához vezethet (Dhawan és mtsai 1996).

A glikoprotein egy vagy több szénhidrátcsoporthoz kovalensen kapcsolt konjugált fehérje. Különféle biológiai eseményekben vesznek részt, például a sejt – sejt kommunikációban, a fehérje stabilitásában, működésében, a forgalomban, a membrántranszportban, a sejtek differenciálódásában és felismerésében (Wiese és mtsai 1997). A thay-k az összes sejt felszínén találhatók, és néhányuk a véráramba és a testnedvekbe kerül, ezáltal a vér és a plazma viszkózusabbá válik (Thirunavukkarasu & Sakthisekaran 2003). Jól dokumentált, hogy a glikoprotein-komponensek, például a hexóz, a hexosamin, a sziálsav és a fukóz szénhidrát-részei hidrofilek, a glikoproteineket sokkal hidrofilebbé teszik, és lehetővé teszik a fehérje számára, hogy megfelelő geometriába hajlítson és biztosítsa a stabilitást (Wu 2003). A glikoprotein-komponensek szénhidrát-szerkezete sok kóros állapotban megváltozik, ideértve a DM-t is (Pari & Murugan 2007; Pari & Karthikesan 2009). A glikoprotein komponensek káros anyagcseréje létfontosságú szerepet játszhat a máj- és vesebetegségek patogenezisében a DM-ben. Azonban az inzulinhiány a DM során a glikoprotein komponensek anyagcseréjének romlását eredményezi, ami a hasnyálmirigy sejtjeinek bazális membránjának megvastagodását eredményezi. Továbbá, a cukorbetegeknél a glikoprotein komponensek szintjének növekedése angiopátiás szövődményeket jelez (Konukoglu et al. 1999).

Számos modern gyógyszer hatékonyan megakadályozza a DM-t, de hosszan tartó alkalmazásuk káros hatásokat okozhat. Ezért jelentős figyelmet fordítottak az étrendi összetevők és a természetes termékek alternatív vagy kiegészítő kezelésére a cukorbetegség kezelésére a szintetikus kábítószerek által okozott káros hatások csökkentése érdekében. A tirozol [4- (2-hidroxi-etil) -fenol] jól ismert fenolvegyület, és főleg extra szűz olívaolajban és fehérborban van jelen (St-Laurent-Thibault et al. 2011). Neuroprotektív, kardioprotektív, gyulladáscsökkentő, rákellenes és antidepresszáns hatást mutat (Bu et al. 2007; Chernyshov et al. 2007; De Stefano et al. 2007; Ahn et al. 2008; Panossian et al. 2008).

Korábban beszámoltunk a tirozol antihiperglikémiás hatásáról streptozotocin (STZ) által kiváltott diabéteszes patkányokban, és dózisfüggő választ mutat a glikémiás kontrollban (Chandramohan et al. 2015). A tirozollal kapcsolatos kutatásaink folytatásaként ebben a vizsgálatban kísérletet tettek a tirozol plazma és szöveti glikoprotein komponensekre gyakorolt ​​hatásainak értékelésére STZ-indukálta diabéteszes patkányokban. A tirozol hatásait összehasonlítják egy szokásos hipoglikémiás gyógyszerrel, a glibenklamiddal. Ezen felül a in vitro a tirozol antioxidáns aktivitását értékelik a hatásmechanizmus megértése érdekében.

Anyagok és metódusok

Vegyszerek

Az STZ-t és a tirozolt a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO) szereztük be. Az összes többi használt vegyszer és oldószer analitikai minőségű volt, és a Hi Media-tól (Mumbai, India) és az SD-Fine Chemicals-tól (Mumbai, India) vásárolta meg őket.

Kísérleti állatok

Körülbelül 180–220 g súlyú hím Albino Wistar patkányokat szereztek be az Annamalai Egyetem Rajah Muthiah Orvosi Főiskolájáról és Kórházáról a Central Animal House-tól, a Kísérleti Orvostudományi Tanszéktől. Tiszta, steril polipropilén ketrecekben helyezték el őket normál viváriumi körülmények között (12 órás fény/sötét ciklus), szabad hozzáféréssel a standard chow-hoz (Hindustan Lever Ltd., Bangalore, India) és a vízhez. A kísérleti protokollt az Annamalai Egyetem Állati Etikai Bizottsága hagyta jóvá (reg. 1002, 2013).

Kísérleti DM indukciója

A DM-t éjszakai éhgyomri patkányokban indukálták STZ egyetlen intraperitoneális injekciójával (40 mg/testtömeg-kg) frissen készített citrátpufferben (0,1 M, pH 4,5) oldva. Az STZ-vel injektált patkányoknak egy éjszakán át 20% -os glükózoldatot inni hagytak, hogy legyőzzék a kezdeti gyógyszer által kiváltott hipoglikémiás mortalitást. Patkányokban a DM indukcióját a megemelkedett plazma glükózszint becslésével igazolták, 72 órával az STZ injekció után, Trinder (1969) módszerével. Azoknál a patkányoknál, akiknél az éhomi plazma glükózszintje meghaladta a 250 mg/dl-t, cukorbetegnek tekintették és a jelenlegi vizsgálathoz választották (Chandramohan et al. 2015).

Kísérleti terv

Összesen 30 patkányt (18 STZ-indukálta diabéteszes patkányt és 12 normál patkányt) alkalmaztunk, és öt csoportra osztottuk őket, mindegyik csoportban hat patkánnyal az alábbiak szerint:

I. csoport: normál kontroll patkányok.

II. Csoport: normál patkányok intragasztrikusan beadva 1 nap tirozolt (20 mg/testtömeg-kg) desztillált vízben oldva 45 napig.

III. Csoport: STZ-indukált diabéteszes kontroll patkányok.

IV. Csoport: STZ-indukált diabéteszes patkányok 1 ml tirozollal (20 mg/testtömeg-kg) kezeltek intragasztrikusan desztillált vízben, 45 napig intranasztrikusan oldva (Chandramohan et al. 2015).

V. csoport: STZ-indukált diabéteszes patkányok 1 ml glibenklamiddal (600 μg/testtömeg-kg) kezeltek, intragasztrikusan oldva desztillált vízben, 45 napig (Chandramohan et al. 2015).

A kísérleti szakasz végén a patkányokat egy éjszakán át megfosztották az élelemtől, ketamin (24 mg/testtömeg-kg) alkalmazásával intramuszkulárisan altattuk, és méhnyak lefejezésével felöltettük őket. A vérmintákat a patkányoktól gyűjtöttük a plazma glükóz, inzulin és glikoprotein komponensek becslésére. A máj- és veseszöveteket azonnal kivágták, jéghideg fiziológiás sóoldattal mosták, szárazra tapogatták és a szövettan szempontjából lemérték.

Biokémiai becslések

A glikoprotein komponensek extrahálása

0,1 ml plazmához 5,0 ml metanolt adunk, jól összekeverjük és 10 percig 3000 ° C-on centrifugáljukg. A felülúszót dekantáltuk, és a csapadékot ismét 5,0 ml 95% -os etanollal mostuk, majd újra centrifugáltuk, és a felülúszót dekantáltuk, hogy a glikoprotein komponensek csapadékát kapjuk. Ezt használták a plazmában levő hexóz, hexozamin, fukóz és sziálsav becslésére.

A glikoprotein komponenseknek a szövetekből (májból vagy veséből) történő extrahálásához a szövet ismert tömegét 7,0 ml metanolban homogenizáltuk. A tartalmat leszűrjük és 14 ml kloroformmal homogenizáljuk. Ezt szűrjük, és a maradékot egymást követően kloroform: metanol (2: 1 térf.) Homogenizáljuk, és az extraktumot minden egyes alkalommal szűrjük. A maradékot (zsírtalanított szövetek) megkapjuk, és a szűrletet dekantáljuk. A zsírtalanított szövetek lemért mennyiségét szuszpendáljuk 3,0 ml 2 N sósavoldatban, és 4 órán át 90 ° C-on melegítjük. A mintát lehűtjük és 3,0 ml 2 N NaOH-oldattal semlegesítjük. Ebből származó mintákat használtunk a szövetekben lévő hexóz, hexosamin, sziálsav és fukóz becslésére (Stanely Mainzen Prince & Kannan 2006; Sundaram et al. 2012).

A plazma glükóz- és inzulinszintjének meghatározása

A plazma glükózszintjét egy kereskedelmi kit (Sigma Diagnostics Pvt. Ltd., Baroda, India) segítségével, Trinder (1969) módszerével becsültük meg. A plazma inzulint ELISA kit segítségével (Boeheringer – Manneheim Kit, Manneheim, Németország) vizsgáltuk.

A glikoprotein komponensek szintjének meghatározása

A hexózt Niebes (1972) módszerével becsülték meg. A reakcióelegy 0,5 ml szövethomogenátot/plazmát, 0,5 ml 5% fenolt és 2,5 ml tömény anyagot tartalmazott. H2SO4 és 20 percig forraljuk, és az abszorbanciát 490 nm-nél leolvassuk.

A hexozamint Elson és Morgan (1933) módszerével becsülték meg, Niebes (1972) enyhe módosításával. Röviden, a reakcióelegy 0,5 ml plazma/1,0 ml szövethomogenátot és 2,5 ml 3 N sósavat tartalmazott. 6 órán át forraljuk, és 6 N NaOH-dal semlegesítjük. 0,8 ml semlegesített mintához 0,6 ml acetil-aceton reagenst adunk és 30 percig forraljuk. Az elegyet 2,0 ml Ehrlich reagenssel kezeltük. A kialakult színt 540 nm hullámhosszon leolvastuk.

A sziilsavat Warren (1959) módszerével határoztuk meg. Röviden, 0,5 ml szövethomogenátumot/plazmát 0,5 ml ionmentes vízzel és 0,25 ml periodikus savval kezelünk, és 37 ° C-on inkubálunk 30 percig. 0,2 ml nátrium-meta-arsenátot és 2,0 ml tiobarbitursavat adunk a reakcióelegyhez, amelyet 6 percig melegítünk. Ezután 5,0 ml savanyított butanolt adunk hozzá, és az abszorbanciát leolvassuk 540 nm-en.

A fukózt Dische és Shettles (1948) módszerével becsültük meg. 0,5 ml szövethomogenátumot/plazmát 4,5 ml H2SO4-tal kezeltünk és 3 percig forraltunk. Ezután cisztein-hidroklorid reagenst (0,1 ml) adunk hozzá. 75 perc elteltével sötétben az abszorbancia leolvasásra került 393 és 430 nm-en. A glikoprotein szinteket mg/100 g-ban fejezzük ki zsírtalanított szöveteknél és mg/dl-t plazmában.

Hisztopatológia

Periodikus sav-schiff (PAS) festés

Normál esetben PAS festést használnak a glikoprotein komponensek hisztopatológiai vizsgálatával történő azonosítására (Kumar & Salimath 2014). A máj- és veseszöveteket eltávolításuk után azonnal 10% -os formalinban tartották, majd 5 µm vastagságú szakaszokat vettek alkoholos (70–100%) mosás és paraffinizálás után. A paraffinmentesítés és a hidratálás után a metszeteket 1% periódusos savba helyeztük 15 percig, majd vízzel mostuk és Schiff reagenssel kezeltük, majd Mayer hematoxylinnel festettük.

Az in vitro vizsgálat

Teljes antioxidáns aktivitás

A tirozol teljes antioxidáns potenciálját a 2,2′-azinobisz (3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav) gyökök (ABTS • +) esszével határoztuk meg, Miller és mtsai. (1996). A reakcióelegy ABTS-t (0,002 M), tirozolt (25–150 μM) és puffert tartalmazott, összesen 3,5 ml térfogatban. Az abszorbanciát 734 nm-en mértük egy Systronics UV-látható spektrofotométerrel.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± szórásként (SD) mutatjuk be, és statisztikai szignifikanciának vetjük alá, majd egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltük, a Statisztikai Csomag a Társadalomtudományokhoz (SPSS) szoftvercsomag 16.0 verziójával (SPSS, Cary, NC). ) és az egyes összehasonlításokat Duncan Multiple Range Test-jével (DMRT) kaptuk. Az értékeket akkor tekintjük statisztikailag szignifikánsnak, ha p A tirozol jótékony hatása a megváltozott glikoprotein komponensekre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban

Online közzététel:

1. ábra: A plazma glükóz és inzulin szintjének változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p 1. ábra: A plazma glükóz és inzulin szintjének változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p A tirozol jótékony hatása a megváltozott glikoprotein komponensekre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban

Online közzététel:

2. ábra A plazma glikoprotein komponensek szintjének változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p 2. ábra: A plazma glikoprotein komponensek szintjének változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p A tirozol jótékony hatása a megváltozott glikoprotein komponensekre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban

Online közzététel:

3. ábra: A máj glikoprotein komponenseinek koncentrációjának változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p 3. ábra: A máj glikoprotein komponenseinek koncentrációjának változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p A tirozol jótékony hatása a megváltozott glikoprotein komponensekre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban

Online közzététel:

4. ábra A vese glikoprotein komponenseinek koncentrációjának változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p 4. ábra A vese glikoprotein komponenseinek koncentrációjának változásai. Minden oszlop átlag ± SD minden csoportban hat patkánynál. Az értékek statisztikailag szignifikánsak a p A tirozol jótékony hatása a megváltozott glikoprotein komponensekre streptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban

Online közzététel:

5. ábra (A – J) PAS-val festett patkány máj- és veseszakaszok hisztopatológiája. (A, F) normál kontroll patkányok (100x), (B, G) normál patkányok tirozollal (100x), (C, H) diabéteszes kontrollpatkányok (100x), (D, I) diabéteszes patkányok kezeltek tirozol (100 X), (E, J) cukorbeteg patkányok glibenklamiddal (100 X) kezeltek.

5. ábra (A – J) PAS-val festett patkány máj- és veseszakaszok hisztopatológiája. (A, F) normál kontroll patkányok (100x), (B, G) normál patkányok tirozollal (100x), (C, H) diabéteszes kontrollpatkányok (100x), (D, I) diabéteszes patkányok kezeltek tirozol (100 X), (E, J) cukorbeteg patkányok glibenklamiddal (100 X) kezeltek.

A tirozol hatása a teljes antioxidáns aktivitásra

A in vitro A tirozol teljes antioxidáns aktivitását ABTS • + scavenging módszerrel értékeltük. Az ABTS • + gátlása a tirozol koncentrációfüggő (25, 50, 75, 100, 125 és 150 μM) eltávolító aktivitását mutatta (6. ábra). A tirozol százalékos eltávolító aktivitása növekszik a koncentráció növekedésével. A tirozol legmagasabb százalékos (83,73%) eltávolító aktivitását azonban 150 μM koncentrációnál figyelték meg. A tirozol hatása in vitro összehasonlítottuk egy szokásos, butilezett hidroxitoulénnel (BHT).

Online közzététel:

6. ábra A in vitro a tirozol teljes antioxidáns aktivitása. Az oszlopok a három párhuzamos kísérlet átlagát jelentik.

6. ábra A in vitro a tirozol teljes antioxidáns aktivitása. Az oszlopok a három párhuzamos kísérlet átlagát jelentik.

Vita

Diabéteszes állapotban a glikoprotein metabolizmus rendellenességeit általában megfigyelik (Anil Kumar et al. 2005). Megfigyeltük a megemelkedett hexóz-, hexozamin-, sziálsav- és fukózszinteket az STZ-indukálta diabéteszes kontroll patkányok plazmájában. A sejtmembrán glikokonjugátumok szekréciója vagy a vérkeringésbe kerülése a plazma glikoprotein komponenseinek emelkedéséhez vezet. Emellett az inzulinhiány és a magas plazma glükózszint cukorbetegségben a glikoprotein komponensek fokozott szintézisét eredményezheti (Patti és mtsai 1999). Az STZ-indukált diabéteszes patkányok tirozol- és glibenklamid-kezelése antihiperglikémiás hatásai miatt a plazma glikoprotein-összetevőit a normális szint közelébe csökkentette.

A hexozamin egy nitrogéncukor, amelyben egy aminocsoport helyettesíti a hidroxilcsoportot. A hexozamin szintje jelentősen emelkedett a cukorbeteg patkányok plazmájában és szöveteiben, ennek oka lehet inzulinhiány. Továbbá az egyidejű oxidatív stressz növeli a GFAT (Glutamin: Fruktóz-6-foszfát-amino-transzferáz) expresszióját, ennek az útnak a sebességkorlátozó enzime, amely magasabb hexozaminszinthez vezet (Brownlee 2005). A sejtmembránban a fehérjéhez kötött hexóz hidrofób természetet biztosít. Ebben a vizsgálatban a cukorbeteg patkányok plazmájában és szöveteiben megnövekedett hexózszinteket figyeltünk meg, ami a glükóz inzulinfüggő úton történő depressziós felhasználásának tudható be, ezáltal fokozva a hexóz és a hexosamin képződését a glikoproteinek felhalmozódásában (Patti et al., 1999). A tirozollal és glibenklamiddal végzett kezelés jelentősen csökkentette a hexóz és a hexozamin szintjét, ami annak antihiperglikémiás hatásainak köszönhető.

A fukóz egy olyan nyolc esszenciális cukorcsoport tagja, amelyekre a szervezetnek szüksége van a sejtek közötti kommunikáció optimális működéséhez, és anyagcseréje megváltozottnak tűnik a különböző betegségek, például a DM esetében (Mondoa & Kitei 2001). Wiese és mtsai. (1997) szerint a szérum és a máj fukoziltranszferáz és fukozidáz aktivitása fokozott az STZ által kiváltott diabéteszes patkányokban. A fukozilezési reakciók egyedülálló funkcionális tulajdonságokat kölcsönöznek a glikoproteineknek. Az STZ-indukálta diabéteszes kontroll patkányokban a máj és a vese fukozilált fehérjeinek megfigyelt megnövekedett koncentrációja ennek a fehérje fokozott szintézisének és csökkent lebomlásának tudható be. Az STZ által kiváltott diabéteszes patkányok tirozollal végzett kezelése antihiperglikémiás hatásai révén jelentősen csökkent a fukózkoncentráció, ami a fukozilált fehérje szintjének szabályozásának köszönhető.

A biokémiai eredményeket megerősítve elvégeztük a máj és a vese PAS festését is. A PAS-vel festett szakaszok kimutatták a glikoproteinek felhalmozódását a cukorbeteg patkányok májában és veséjében. A tirozollal kezelt diabéteszes patkányok normális máj- és vesemorfológiát mutattak, ami azt jelzi, hogy a tirozol csökkentette a glikoprotein komponensek felhalmozódását az STZ-indukálta diabéteszes patkányokban.

Továbbá tanulmányoztuk in vitro a tirozol felszívó hatása az ABTS • + -ra. Az ABTS • + kationgyök színtelenítése egyértelmű módszer a fenolos vegyületek antioxidáns aktivitásának mérésére. Vizsgálatunkból kiderült, hogy a tirozollal átitatott ABTS • + koncentráció függő. A tirozol 150 μM koncentrációban mutatta a legnagyobb öblítő hatást a másik öt dózishoz (25, 50, 75, 100 és 125 μM) képest. Eredményeink kimutatták a tirozol határozott eltávolító aktivitását az ABTS • + irányába a butilezett hidroxitoulénhez (BHT) képest. Így a tirozol erős antioxidáns.

Összegzésképpen elmondható, hogy a tirozollal végzett kezelés antidiabetikus hatása mellett csökkentette a glikoprotein komponensek felhalmozódását az STZ által kiváltott diabéteszes patkányokban. A tirozol is kiállított in vitro antioxidáns tulajdonság. A tirozol megfigyelt hatása a hiperglikémia káros hatásainak csökkentésére betekintést nyújt a diabéteszes szövődmények patogenezisébe, és terápiás megközelítésekben is felhasználható.