Az indonéz gyermekek székletétől kezdve az elválasztásig terjedő mikrobiómák különböztek anyjuk mikrobiómáitól

Kutatási papír

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Kiegészítő
Idézetek
Metrikák
Engedélyezés
Újranyomtatások és engedélyek
PDF
EPUB

ABSZTRAKT

Bevezetés

Eredmények

A csecsemők és anyáik székletmikrobiota profiljai

Amint az 1a. Ábra mutatja, a csecsemők székletének mikrobiota profiljait az anyákétól elkülönítve csoportosították (o Az indonéz gyermekek székletétől kezdve az elválasztásig terjedő mikrobiómák különböztek anyjuk mikrobiómáitól

Online közzététel:

1. táblázat: OTU-k megosztása az anyák mintái és a gyermekek székletmintái között (%).

Az anyák hüvelyi mikrobiota profilja

A csecsemő korcsoportok egyikében sem volt olyan gyermek széklet mikrobiota profilja, amely közel állt az anyai hüvelyi mikrobiota profilokhoz (2a, b ábra), annak ellenére, hogy az összes csecsemőt hüvelyi úton szállították. A gyermekek székletének közös mikrobiota az élet első hónapjában és az anyák hüvelye 9,2% volt (1. táblázat). A rengeteg Prevotella a hüvelyi mikrobiotában volt a legmagasabb, amikor a gyermekek 1 hónapnál fiatalabbak voltak (2b. ábra), és ezt követően fokozatosan csökkent. Lactobacillus az élet első hónapjától eltekintve volt a legelterjedtebb a különböző korcsoportokban. 24 hónapos életkor után, Prevotella a legtöbb gyermek székletének kb. 10% -át tette ki (a gyermekek 66,7% -a).

Online közzététel:

4. ábra A citokinek koncentrációjának összehasonlítása 1 hónaposnál fiatalabb és 48 hónapos gyermekek székletének vízmintáiban. Az adatokat pg/ml átlagos koncentrációként fejezzük ki. A minták száma zárójelben található az X tengelyen. A = 1 hónapnál fiatalabb, B = 1– 4. ábra. A citokinek koncentrációjának összehasonlítása 1 hónaposnál fiatalabb és 48 hónaposnál idősebb gyermekek széklet vízmintáiban. Az adatokat átlagos koncentrációként fejezzük ki pg/ml-ben. A minták száma zárójelben található az X tengelyen. A = 1 hónapnál fiatalabb, B = 1– Indonéz gyermekek székletének mikrobioma születésétől az elválasztásig különbözött anyjuk mikrobiómáitól

Online közzététel:

5. ábra: Ismert kórokozók (X tengely) és ismert kommensális bélfajok (Y tengely) korrelációja a bőség faji szintjén (a) elválasztás előtt és (b) elválasztás után (6– 5. ábra. Ismert kórokozók (X) korrelációja -axis) és ismert kommensális bélfajok (Y-tengely) a bőség faji szintjén (a) az elválasztás előtt és (b) az elválasztás után (6– indonéz gyermekek székletmikrobioma születésétől az elválasztásig eltért az anyjuk mikrobiómáitól)

Online közzététel:

6. ábra: A szabad epesavak koncentrációjának összehasonlítása - (a) primer epesavak (CDCA, CA) (b) szekunder epesavak (DCA, LCA, UDCA) (c) 12 epesav - gyermekek székletvízmintáiban 1 hónaposnál fiatalabb és 48 hónapos kor között. Bemutatjuk az átlag átlagát és standard hibáját (SEM). A minták számát zárójelben írják le az X tengelyen. A = 1 hónapnál fiatalabb, B = 1– 6. ábra: A szabad epesavak koncentrációjának összehasonlítása - (a) primer epesavak (CDCA, CA) (b) szekunder epesavak (DCA, LCA, UDCA) (c) 12 epesav - 1 hónaposnál fiatalabb és 48 hónapos kor közötti gyermekek székletvízmintáiban. Bemutatjuk az átlag átlagát és standard hibáját (SEM). A minták számát zárójelben írják le az X tengelyen. A = 1 hónapnál fiatalabb, B = 1– Indonéz gyermekek székletének mikrobioma születésétől az elválasztásig különbözött anyjuk mikrobiómáitól

Online közzététel:

2. táblázat: Összefüggés a bélsár baktériumok nemzetségének bősége (a teljes OTU-k> 1% -a) és a gyermekek által elfogyasztott egyes étkezési csoportok (a) 6–12 hónapos, (b) 12–24 hónapos és (c) 24–24 éves kor között. 48 hónap.

Online közzététel:

Az emberi tej oligoszacharidjai elősegítik a Bifidobacterium elválasztás előtt. 44 - 46 Ezenkívül az anyatejben magas a zsírtartalom, 47 ami epesavak szekrécióját indukálhatja a GI-ben, gátolhatja Prevotella és megkönnyítik a Bacteroides és Bifidobacterium, amint arról az irodalom is beszámolt. 48, 49 Szabad primer epesavak magas szintjét detektálták a gyermekek székletvizében az elválasztás előtt (6. ábra). A GI mikrobiomban az elválasztás után bekövetkezett változások a primer epesavak átalakulását eredményezték szekunder epesavakká (6. ábra), amit egy japán csecsemők vizsgálata is alátámaszt. 50

A funkciója Bacteroides és Bifidobacterium az elválasztás előtt, és annak oka, hogy ezek elterjedtek a gyermekek GI-jében, figyelmet igényel. Az indonézek esetében, Bacteroides és Bifidobacterium kevésbé valószínű, hogy hozzájárulnak a tápanyagok emésztéséhez felnőttkorban, amint azt a fő mikrobiota elmozdulása mutatja Bacteroides és Bifidobacterium nak nek Prevotella elválasztáskor (48 hónapos korig) és alacsony előfordulási gyakorisága Bacteroides és Bifidobacterium anyáknál (felnőttek).

Ebben a tanulmányban azt találták, hogy az immunsejtek és az immunrendszer szaporodásáért és éréséért felelős citokinek (IL-1β, −2, −5, −8, −12, TNF-α és IFN-β) elválasztás után felfelé (4. ábra). Ez azt jelenti, hogy a gyermekek aktív immunitása az elválasztási időszak körül alakul ki. Egerek vizsgálatában, Bacteroides fragilis a gyarmatosításról kiderült, hogy elnyomja a gyulladásgátló TH17 sejtválaszokat. 51 A rengeteg Bacteroides Az elválasztás előtt találtak ebben a tanulmányban a pro-gyulladásos sejtek lehetséges downregulációjára utalnak.

Prevotella volt az anyák hüvelymintáiban a leggyakoribb, akiknek gyermekei 16, 19 voltak Prevotella nincs szerepe a magas zsír- és fehérjetartalmú európai és észak-amerikai étrendben az elválasztás után. 8, 11 A létrehozásának belső tényezői Prevotella az anyák hüvelyében a fejlett országban az utóbbi években bekövetkezett táplálkozási szokások változása ellenére is kialakulhatott. A korai emberi étrend nagyrészt zöldségalapú volt, mint a mai indonézek étrendje.

Az anyai mikrobiota átvitelét továbbra is a gyermekek GI mikrobiota fő forrásaként azonosították, mivel a gyermekek összes mikrobiota megtalálható az anyáknál (1-3. Ábra). Azonban az OTU-k magas száma azoknál az anyáknál, amelyeket nem osztottak meg a gyerekekkel (1. táblázat), azt jelzi, hogy az anyák GI, hüvely és anyatej mikrobiota csak kis hányada tudott megalapozni gyermekei GI-jében a korai életkor. Az anyák uralkodó mikrobiotájának nem volt előnye a gyermekek GI traktusainak gyarmatosításában. Az egyik magyarázat a csecsemők GI gyarmatosítására az anyák nem domináns törzsei között lehet a csecsemők specifikus funkcionális génjeinek szelektív preferálása. 23., 52

A GI mikrobiota nemcsak vertikálisan, hanem vízszintesen is átvihető. Mindazonáltal, amint ez és más tanulmányok is kiderült, az életkor előrehaladtával nőtt az anyák és a gyermekek közötti közös széklet OTU aránya (1. táblázat). 22, 24 Az a tény, hogy az idősebb gyermekek székletmintái több OTU-t osztottak meg anyjuk hüvelyi tamponjával, mint a fiatalabb gyermekek, tükrözheti az indonéz alanyok személyes higiéniai gyakorlatát (1. táblázat).

Bifidobacterium negatívan kapcsolódott a komplex szénhidrátokhoz, a helyi gyümölcsökhöz és a tejtermékekhez különböző korcsoportokban. Ez a tanulmány (2. táblázat) alátámasztja a negatív összefüggés korábbi 10 megállapítását Bifidobacterium rezisztens keményítő jelenlétével. Indonézia fő szénhidrátja az Indica rizs, amely magas rezisztens keményítőtartalommal rendelkezik. Az elválasztás utáni rizsfogyasztás és a gyomor-bél traktusban való kitartás miatt jelenléte a szabad epesavak eltávolításához vezet a lumenből, ami lehetővé tette Prevotella szaporodni és csökkenteni a bőségét Bifidobacterium, ahogyan azt az irodalom javasolja. 10.

kívül, Prevotella egy szénhidrát fermentor, 10, 11, amely szaporodna az indonézek magas szénhidráttartalmú étrendjében. Továbbá úgy tűnik, hogy a helyi gyümölcsök és tejtermékek gátolták a szaporodását Bifidobacterium erős dózisfüggő anyagban (2. táblázat). A helyi gyümölcsök antimikrobiális biomolekulákat állíthatnak elő önmegőrzés céljából magas hőmérsékletű környezetben, ami elősegíti a mikrobák szaporodását. 55 - 57 Jelen esetben, Bifidobacterium az egyik érzékeny mikroba lehet, amelyet tovább kell ellenőrizni. Ez megmagyarázhatja a bőségének drasztikus csökkenését Bifidobacterium elválasztás utáni gyermekek székletmintáiban és alacsony mennyisége az anyákban (1. ábra). Különleges esetekben, amikor a gyerekek több gyorséttermet fogyasztanak, a búzalapú ételek, például a zsemle és a burgonya chipsben lévő emészthető szénhidrát pozitív összefüggéshez vezethet a gyorsételek és a Bifidobacterium (2. táblázat). 10, 58

Egészségfejlesztő funkciói Bifidobacterium Az európai, észak-amerikai és kelet-ázsiai gyermekeknél megfigyelt 29 - 32, 43, 54 gyermekek az indonézeknél más kommenzális baktériumokkal, pl. Enterococcus faecalis. 59, 60 24–48 hónapos korában érett, kiegyensúlyozott, az anyákéhoz hasonló mikrobióma fejlődhetett ki a gyermekekben az étrendjük konvergenciája miatt. Az immunrendszer 24–48 hónapon belül megközelíthette az érést, ami a szabályozó citokinek, nevezetesen az IL-1β, −2, −5, −8, −12, TNF-α és IFN-γ szabályozásához vezetett (4. ábra).

Következtetések

A tanulmány szerint:

A csecsemőkben az uralkodó baktériumok megtelepedése viszonylag gyors (a születéstől számított egy hónapon belül), és ezt csak kis számú vetődő baktériumsejt indíthatja el az anyáktól, mint pl. Bacteroides és Bifidobacterium amelyek a kisebbségi mikrobiota részei voltak az anya összes mintájában (széklet, anyatej és hüvely).

Az elválasztás előtti gyermekek túlsúlyban lévő mikrobiotája belső és külső tényezőkkel, például epekoncentrációval és citokinekkel, valamint esetleg tejoligoszacharidokkal és mucin-glikánokkal társul (amelyeket az irodalom javasol, és amelyeket ebben a tanulmányban nem mérnek), amelyek kedvezhetnek Bacteroides és Bifidobacterium.

Bacteroides és Bifidobacterium az elválasztás előtt negatívan kapcsolódnak a potenciális kórokozókhoz. A fertőző betegségek elleni védekezésben betöltött szerepüket klinikai vizsgálatok során ellenőrizni kell.

Az elválasztás utáni étrendi váltás megváltoztatja a gyermekek székletének mikrobiotáját Bacteroides és Bifidobacterium nak nek Prevotella.

Összességében az adatok arra utalnak, hogy a gyermekek mikrobiota profilját nagyrészt a GI-környezet és az étrendi összetevők határozták meg, nem pedig az anya transzferje. Más szavakkal, bizonyos belső és külső tényezők meghatározhatják az előnyben részesített mikrobiotát, amely a gyomor-bél traktusban kolonizál. Ennek fontos következményei vannak a GI mikrobiota dysbiosis orvoslására.

Mód

Dizájnt tanulni

Tantárgyak toborzása

Háromszáz egészséges indonéz anyát és 4 év alatti gyermeküket toborozták az indonéziai Yogyakarta három közösségi egészségügyi központjából. Az alanyok toborzásának kritériumai az voltak, hogy a gyermekek normális hüvelyi szüléssel születtek, születésükkor nem voltak kórházi kórházi kórokozói súlyos kórkép miatt, és kizárólag elválasztási időszak előtt szoptatták őket (6-TM PicoGreen® készlet (Invitrogen, USA). A mennyiségi meghatározás után az egyes DNS-mintákat körülbelül 12,5 ng-ra normalizáltuk a polimeráz láncreakcióhoz (PCR).

16 S rRNS amplikon termelés és tisztítás

A KAPA HiFi TM PCR készletet (Kapa Biosystems, USA) a PCR-ben 16 S rRNS DNS amplikon termelésre alkalmaztuk. Az egyes DNS-minták reakcióelegyei 12,5 μl 2x KAPA HiFiHotStart Ready Mix-et, 0,5 μl előre és hátra láncindítót és 11,5 μl normalizált DNS-mintát tartalmaztak. A PCR-t egy termociklerben az alábbiak szerint hajtottuk végre: kezdeti denaturálás 95 ° C-on 3 percig, majd 25 denaturációs ciklus 95 ° C-on 30 másodpercig, hevítés 55 ° C-on 30 másodpercig, meghosszabbítás 72 ° C-on 30 percig másodpercig, és egy utolsó meghosszabbítási ciklust 72 ° C-on 5 percig. A PCR után a termékeket Agencourt®AMPure®XP gyöngyökkel (Beckman Coulter, USA) tisztítottuk, és 50 μl 10 mMTris pufferben (pH 8,5) újraszuszpendáltuk.

Mutatók és adapterek hozzáadása az Index PCR-hez és a termékek tisztítása

Az egyes DNS-minták reakcióelegyei 12,5 μl 2x KAPA HiFiHotStart Ready Mix-t, 5 μl i7 és i5 primert (Illumina, USA) és 5 μl az előző PCR-ben előállított DNS-amplikonokat tartalmaztak. A PCR-t a következőképpen hajtottuk végre: kezdeti denaturálás 95 ° C-on 3 percig, majd nyolc ciklus denaturálás 95 ° C-on 30 másodpercig, hevítés 55 ° C-on 30 másodpercig, meghosszabbítás 72 ° C-on 30 másodpercig, és végső meghosszabbítás 72 ° C-on 5 percig. Az előállított könyvtárakat újból Agencourt®AMPure®XP gyöngyökkel tisztítottuk és 25 μl 10 mM Tris pufferben (pH 8,5) szuszpendáltuk.

Könyvtári normalizálás, összesítés és újrakvantifikálás kvantitatív PCR-rel (qPCR)

Az egyes minták könyvtári koncentrációját a Quant-it TM PicoGreen® készlettel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mértük. Ezután az egyes könyvtárakat a kívánt koncentrációra 10 mM Tris pufferral (pH 8,5) normalizáltuk, és az egyes normalizált könyvtárakból 5 μl-t csőbe egyesítettünk. Az így kapott összevont amplikon könyvtárat (PAL) qPCR-n keresztül újra kvantifikáltuk a KAPA Library Quantification Kit (Kapa Biosystems, USA) segítségével a gyártó protokollja szerint.

A könyvtár és a PhiX Control denaturálása, hígítása

DNS-szekvencia adatok elemzése

Kvantitatív betekintés a mikrobiális ökológiába (QIIME) 16 S rRNS DNS amplikon adatelemzésben

A kapott 16 S rRNS DNS szekvencia adatait QIIME 1.9.1 verzióval elemeztük. A QIIME-ben a megfelelő visszirányú és előreolvasásokat összekötöttük, és az eredményül kapott páros olvasásokat a Q-pontszám 25 alapján választottuk ki. A kiméra szekvenciákat kiszűrtük és eltávolítottuk az USEARCH v6.1 alkalmazásával. A kapott szekvenciákat ezután nyílt referenciájú OTU szedésnek vetettük alá, Greengenes v13_8-at használva referencia adatbázisként és 97% -os hasonlósági küszöböt használva. Ezután az OTU-kat taxon-összefoglaló segítségével térképezték fel a minták bakteriális profiljának további értelmezése érdekében. A baktérium nemzetség adatait tovább elemeztük az anyák és a gyermekek profiljának összehasonlítása céljából. Kiszámították az anyák és a gyermekek mintái közötti megosztott OTU-k átlagos százalékát is az egyes gyermekek korcsoportjában. A Canoco5 szoftvercsomag (Microcomputer Power Co, Ithaca, USA) segítségével egy fő komponens elemzést (PCA) végeztek a Bray-Curtis távolságok négyzetgyökén a baktérium nemzetség adatainak relatív bősége alapján.

Korrelációs index

A korreláció mértékének számszerűsítésére korrelációs indexet alkalmaztunk, amely a kommenzálok és a potenciális kórokozók korrelációs értékeinek összegzését tartalmazza (r). A nulla értékű korrelációs index nem jelenti azt, hogy a kommenzálisok és kórokozók között nincs korreláció. A maximális pozitív korrelációs index 168 (15 kommensál x 14 kórokozó x 0,8), míg a legmagasabb negatív korrelációs index −84 (15 kommenzál x 14 kórokozó x [−0,4]). A lehetséges kórokozók közé tartoztak Neisseria, Pseudomonas, Bacteroides fragilis, Campylobacter ureolyticus, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella, Prevotella melaninogenica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidalagia, Streptococcus, és Streptococcus anginosus. A közönséges fajok közé tartoztak Akkermansia, Bifidobacterium, Blautia, Enterococcusok, Faecalibacteria, Lactobacilli, Ruminococcusok, Escherichia coli, Egyéb Bacilli, Egyéb Bacteroides, Egyéb Campylobacter, Egyéb Clostridia, Egyéb Prevotella, Egyéb Staphylococcusok, és egyéb Streptococcusok.

Széklet víz előkészítése

0,01 M fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) (Sigma-Aldrich, USA) és 1% szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) PBS-oldatban készült elegyét frissen készítettük. Körülbelül 1 g frissen gyűjtött székletmintát vortexeléssel összekevertünk az elkészített PMSF-BSA-PBS oldat kétszeresével. 5 percig 4000 g sebességgel végzett centrifugálás után a felülúszót új csőbe helyeztük, majd 10 percig 4000 g sebességgel centrifugáltuk. A felülúszót egy másik új csőbe helyeztük, és további elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk.

Széklet víz citokinek elemzése

A LUNARIS TM Human 11-Plex citokin kit (AYOXXA Biosystems, Ausztria) segítségével az IL-1β, IL-2, IL-4, Il-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL- A 12. ábrán IFN-y, TNF-a és GM-CSF értékeket mértünk. A felolvasztott és tiszta székletvíz felülúszóját 1-es vizsgálati hígítóval hígítottuk. A hígított standardokat, hígított mintákat és üres anyagokat (ismétléseket) először 384-lyukú mikrolemezen készítettük. Mindegyiküket áthelyezték egy LUNARIS TM BioChip-be, és a gyártó protokollja szerint készítették el. A fluoreszcencia képeket fluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axio Imager M2, Zeiss, Németország) készítettük, és a mennyiségi meghatározást a LUNARIS TM tartozékkészletben (AYOXXA Biosystems, Ausztria) található LUNARIS TM elemzőcsomaggal végeztük.

Epesavak elemzése

Az elválasztott élelmiszerek kérdőív elemzése

Az ételeket tíz csoportba sorolták: összetett szénhidrátok, zöldségek, hüvelyesek és szója, gyümölcsök, húsok, tejtermékek, snackek, italok, gyorsételek és ételízesítők (S1 szöveg). Az elválasztott gyermekek által elfogyasztott egyes élelmiszerek rögzített gyakoriságát és adagméretét napi fogyasztásként számoltuk ki, majd tovább alakítottuk a napi összes gramm mennyiségre.

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést és az adatok vizualizálását GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., USA) és R 3.5.2 (RStudio, Inc., USA) szoftverekkel végeztük. Permutációs többváltozós varianciaanalízist (PERMANOVA) hajtottunk végre a páronkénti Adonis R csomag segítségével. 63 A o értékeket post-hoc Bonferroni többszörös összehasonlításokkal korrigáltunk. A kétirányú varianciaanalízist (ANOVA) és a post-hoc Bonferroni többszörös összehasonlító tesztet a baktérium nemzetségek, a széklet víz citokinjeinek és az epesavak relatív bőségének adataival végeztük, hogy ellenőrizzük a baktériumok bőségének eloszlásában tapasztalható jelentős különbségeket ( > A teljes OTU-k> 1% -a), citokinek és epesavak a mintákban a gyermekek korcsoportjai, valamint a gyermekek és az anyák mintái között. A Kruskal-Wallis tesztet és a poszt-hoc Dunn többszörös összehasonlító tesztet végeztük, hogy megvizsgáljuk, hogy az egyes táplálékcsoportokban jelentős különbségek vannak-e az elválasztás után a különböző életkorú gyermekek között. A Spearman nem-parametrikus korrelációs tesztet alkalmazták az ismert bélkommanális fajok és potenciális kórokozók OTU-i, valamint a baktériumnemzetségek 1% -a és a különféle súlycsoportú élelmiszercsoportok közötti összefüggések azonosítására az R 64 mikrobiom és a GraphPad Prism 8 alkalmazásával.

1. táblázat: OTU-k megosztása az anyák mintái és a gyermekek székletmintái között (%).