Nemi különbségek az öregedésben, az élettartamban és a spontán tumorgenezisben a metforminnal újszülöttnek kitett 129/Sv egerekben

JELENTÉSEK

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Kimutatták, hogy a perinatális (prenatális és korai újszülött) periódus kritikus szakasz a szexuális dimorfizmus differenciálódásának, valamint az energiamérleg és az anyagcsere áramkör kialakulásának. 5-7 Barker hipotézise a rossz perinatális környezet, például az alultápláltság és a fokozott betegség-fogékonyság közötti összefüggésekről az elmúlt években jelentős figyelmet keltett. 8 Feltételeztük, hogy a korai életkorú metformin-kezelésnek hosszú távú késői hatása lehet, és ebben a cikkben bemutatjuk az eredményeket, amelyek szerint az újszülöttkori metformin-expozíciónak jelentős nemi függő hatása van az egerek élettartamára, hosszú élettartamára és tumorigeneisére.

Eredmények

Az életkorral kapcsolatos testtömeg-dinamika

A 129/Sv hím egerek egész életük során nehezebbek voltak a nőknél, mind a kontrollcsoportban, mind az újszülötten metformin csoportokkal kezelteknél (1A. Ábra). A metforminnak kitett hímek testtömege gyakorlatilag a megfigyelés teljes időtartama alatt alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoportba tartozó férfiaké, míg a metforminnal kezelt nők testtömeg-növekedése gyorsabb volt, és súlyosabb, mint a kontrollcsoportban (1A. Ábra).

Online közzététel:

1. ábra Néhány paraméter életkorhoz kapcsolódó dinamikája újszülötten és nem metforminnal kezelt hím és nőstény 129/Sv egerekben. (A) Testsúly. (B) Ételfogyasztás. (C) Ivóvízfogyasztás. (D) Testhőmérséklet (nőstények); *- P 1. ábra Néhány paraméter életkorhoz kapcsolódó dinamikája újszülötten és nem metforminnal kezelt hím és nőstény 129/Sv egerekben. (A) Testsúly. (B) Ételfogyasztás. (C) Ivóvízfogyasztás. (D) Testhőmérséklet (nőstények); *- P Nemi különbségek az öregedésben, az élettartamban és a spontán tumorgenezisben a metforminnal újszülöttnek kitett 129/Sv egerekben

Online közzététel:

1. táblázat: Az újszülött metforminnal végzett kezelése az ösztrikus funkció paramétereire nőstény 129/Sv egerekben

Metabolikus és hormonális paraméterek metforminnal kezelt egerekben

A szérum inzulin szintje alacsonyabb volt, míg a szérum IGF-1, a koleszterin és a nitrogén-oxid szintje emelkedett a 3 hónapos kontroll nőknél, összehasonlítva a kontroll férfiakkal (2. táblázat).

Online közzététel:

2. táblázat: Néhány metabolikus és hormonális paraméter a kontroll hímeknél és nőstényeknél 129/Sv különböző életkorban

A 3 és 9 hónapos hím kontroll egerek között a glükóz, az összes koleszterin, a trigliceridek, az inzulin és néhány más anyagcsere- és hormonparaméter szintje nem mutatott életkorfüggést, de a malon-dialdehid, az IGF-1 és a nitrogén-oxid szintje között ( NO) a 9 hónapos kontroll férfiaknál magasabb volt, mint a 3 hónapos férfiaknál. 9 hónapos kontroll nőknél a malon-dialdehid és az IGF-1 szintje megemelkedett a 3 hónapos nőknél, míg a koleszterinszint csökkent. Az újszülött metforminnal való expozíciója gyakorlatilag nem változtatta meg a hím és nőstény egerek vérszérumában a hormonális és metabolikus paraméterek mértékét (3. táblázat).

Online közzététel:

3. táblázat: Újszülött metformin-kezelés hatása néhány metabolikus és hormonális paraméterre 3 hónapos hím és nőstény 129/Sv egerekben, újszülöttesen és nem metforminnal kezelve

A 129/Sv egerek túlélése és élettartama

A kontroll és a metforminnal kezelt hím és nőstény egerek túlélési dinamikáját a 2A. Ábra és be 4. táblázat. Érdemes megjegyezni, hogy a férfi és a női kontrollok közötti élettartam-megoszlásban nincs különbség (P-értéke 0,571, χ 2 = 0,3). A metforminnal végzett kezelés nyilvánvalóan némileg eltérő hatást váltott ki a hím és nőstény egerek túlélésében, mivel a hím és nőstény metformin hatására történő élettartam-eloszlásának különbsége statisztikailag szignifikánssá vált (P-értéke 0,0474, χ 2 = 3,9).

Online közzététel:

4. táblázat: Az újszülött metforminnal végzett kezelésének hatása a 129/Sv egerek túlélésére

Online közzététel:

2. ábra Túlélés (A) és a tumor hozama (B) görbék hím és nőstény 129/Sv egerekben, újszülöttesen és nem metforminnal kezeltek.

Férfiaknál a metformin-kezelés szignifikánsan megnövelte az összes egér átlagos élettartamát (+ 20%, P Nemi különbségek az öregedésben, az élettartamban és a spontán tumorgenezisben a metforminnal újszülöttnek kitett 129/Sv egerekben

Online közzététel:

5. táblázat: Újszülötten kezelt és nem metforminnal kezelt hím 129/Sv egerek élettartamának paraméterei

A Gompertz-modell becsült paraméterei a metforminnal kezelt hím egerek csoportjára a kezdeti mortalitás (β) és a mortalitási ráta megduplázódási idejének (MRDT) szignifikáns csökkenését mutatják. A metformin-kezelések megnövelték az átlagos élettartamot a férfiak (hosszú életűek) csoportjában. A Gompertz túlélési modell becsült paraméterei a metforminnal kezelt nőstények csoportjánál a kezdeti mortalitás és az MRDT szignifikáns növekedését mutatják. A Gompertz-modell α-paramétere, amelyet az öregedés arányaként értelmeznek, 1,5-szer alacsonyabb volt a férfi kontrollcsoportban, mint a nőknél, és 1,7-szeresére nőtt a metformin-kezelésben részesített férfiaknál a kontroll férfiaknál, míg a nőknél ez 1,2-szeresére csökkent (5. táblázat).

A log-rank teszt szerint a metforminnal kezelt 129/Sv egerek feltételes élettartam-eloszlása a korai életkorban szignifikánsan különbözött a kontroll populációtól. A különbség sokkal jelentősebb hím egereknél (χ 2 = 11,8; p = 0,000601), mint nőstényekben (χ 2 = 3,7; p = 0,0555). A Cox regressziós modelljének becsült paraméterei szerint az újszülöttkori metformin-kezelések 29 nőtték a nőstény egerek relatív halálozási kockázatát és csökkentették hímeknél a megfelelő intakt csoportokhoz képest. A változások jelentősek a férfiak és a nők esetében. Cox regressziós modelljének paraméterei hímekre vonatkoztak: β = −0,767; exp (p) = 0,464; se (p) = 0,228; p = 0,00075; nőstényeknél: β = 0,246; exp (p) = 1,28; se (p) = 0,128; p = 0,056.

Spontán tumorfejlődés 129/Sv egerekben

A spontán tumor fejlődésének az életkorral összefüggő növekedésének dinamikája a 2B. Ábra. A daganatos egerek átlagos élettartama 4% -kal nőtt a metforminnal kezelt férfiaknál, és a nőknél változatlan volt (6. táblázat). A log-rank teszt szerint a metforminnal kezelt tumoros 129/Sv egerek feltételes élettartam-eloszlása szignifikánsan különbözött a kontroll csoportokétól. Férfiaknál: χ 2 = 1,8; p = 0,177; nőstényeknél: χ 2 = 3,2; p = 0,0739. A Cox regressziós modelljének becsült paraméterei szerint a metformin-kezelés szignifikánsan megnövelte a nőstény egerek halálozásának relatív kockázatát a megfelelő kontroll csoporthoz képest: β = 0,286; exp (p) = 1,33; se (p) = 0,161; p = 0,076.

Online közzététel:

6. táblázat: A tumorgenezis paraméterei újszülötten és nem metforminnal kezelt 120/Sv egerekben

A hosszú rangú teszt 29 szerint nem volt szignifikáns különbség az összes daganat előfordulásának életkorfüggő megoszlásában mindkét nem kontroll és metforminnal kezelt csoportjában. Az első daganatos hím egér a metforminnal kezelt csoportban 408 napos korban, 472 napos korában elhunyt a kontroll férfi csoportban. A hatékony kontroll hím egerek teljes daganatos előfordulása (a kísérlet első daganatának haláláig fennmaradt) 14,6% és 15% volt a metforminnal kezelt állatokban (6. táblázat). Nem volt szignifikáns különbség a rosszindulatú vagy jóindulatú daganatok előfordulásában a kontroll és a metforminnal kezelt hím egerek csoportjai között.

A nőstény egerekben a tumor teljes előfordulása hasonló volt a kontroll és a metforminnal kezelt csoportokban. A jóindulatú vaszkuláris daganatok 129/Sv nőstény nőstényekben alakultak ki leggyakrabban (6. táblázat), összhangban a 30 egér törzs onkológiai jellemzőivel, és előfordulása nem különbözött a metformin és a kontroll csoportok között. A metforminnal kezelt vagy nem kezelt egerek között más tumorok előfordulásában nem volt szignifikáns különbség. Nőstény tumormentes egerekben a metformin jelentősen csökkentette a hosszú életű állatok átlagos élettartamát. Daganatmentes hímeknél a metformin kezelés szignifikánsan megnövelte az összes állat átlagos élettartamát, valamint a hosszú életű egerek átlagos élettartamát a kontroll daganatmentes alcsoporthoz képest. A metforminnal kezelt tumormentes hímek életciklus-megoszlása szignifikánsan különbözött a megfelelő kontroll csoporttól (χ 2 = 9,7; p = 0,00184). A Cox regressziós modelljének becsült paraméterei szerint a metformin-kezelés szignifikánsan csökkentette a daganatmentes hím egerek halálozásának relatív kockázatát a kontroll csoporthoz képest: β = - 0,74; exp (p) = 0,477; se (p) = 0,222; p = 0,0023).

Vita

Online közzététel:

7. táblázat: A nem és a metformin kezelés kezdetének hatása a biomarkerekre, az élettartamra és a tumorgenezisre 129/Sv egerekben

A megfigyelt különbségek másik lehetséges oka a fiziológia nemi sajátosságaival kapcsolatban a gyógyszerek, köztük a metformin célpontjaiban. Ez a kérdés külön megbeszélést igényel. Úgy gondoljuk, hogy az újszülöttek metforminnal végzett kezelése különböző módokon programozta át az energia és a reproduktív homeosztázis hipotalamusz-szabályozását férfiakban és nőkben. Kétféle megfigyelést kell figyelembe venni a probléma értékelése során.

Először kimutatták, hogy a metforminnal (300 mg/kg) kezelt egérgátak felnőtt hím utódainál a glükóz tolerancia és az éhomi éhgyomri szint emelkedik a terhesség 1. és 18. napjától, míg nőstény utódoknál ez a hatás nem figyelték meg. A testtömeg nőtt a metforminnal prenatálisan kitett nőstény egerek utódainál abban az időszakban, amikor az egereket mind a szokásos étrendben, mind a magas zsírtartalmú étrendben tartották, míg hím utódokban a testtömeg növekedett a magas zsírtartalmú étrend időszakában. A génkészlet-dúsítási elemzés kimutatta, hogy a légzési elektron transzport gazdagabb metforminnal kitett hím utódokban. A szerzők azt javasolták, hogy a prenatális metformin expozíció átprogramozza a test energiaháztartásának központi szabályozását. 32

Másodszor érdemes megjegyezni, hogy a korai életkorú növekedési hormon kezelés rövidítette a hosszú élettartamot és csökkentette a sejtes stressz-ellenállást a hosszú életű Ames törpe egerekben. 33 Ezek a megfigyelések határozottan azt sugallják, hogy a törpe egerekben a fejlődés során a növekedési hormon hiánya fontos kivételes hosszú élettartamuk szempontjából, és hogy a korai fejlődés során a GH-jel csökkent szintje kritikus a hosszú élettartam szempontjából.

Több évvel ezelőtt eredetileg azt javasolták, hogy antidiabetikus biguanidokat alkalmazzanak a kalória-korlátozás (CR) utánzó szereként és egy lehetséges öregedésgátló kezelésként. 13 Számos tanulmány kimutatta, hogy az antidiabetikus biguanidok (fenformin, buformin és metformin) felnőtt korban történő beadása növelte az élettartamot, és elnyomta a spontán és indukált tumorgenezist. 2, 34–38 Érdemes megjegyezni, hogy a hím és nőstény felnőtt 129/Sv egerek eltérő reakciót mutattak ugyanazon dózisú metforminnal szemben. A metforminnal nem sikerült meghosszabbítani a hím F344 patkányok élettartamát. 27.

A rapamicin emlős célpontjának gátlója (mTOR) nagyobb mértékben növelte a nők túlélését, mint hím hibrid egereknél. Érdemes megjegyezni, hogy az átlagos élettartam-meghosszabbodást nőstény egereknél figyelték meg (+ 20,4%), a hím S6K1 -/- egereknél azonban nem. A riboszomális S6 protein kináz 1 (S6K1), a tápanyag-reagálóképes mTOR jelátviteli útvonal összetevőjének törlése megnövelte az egerek élettartamát és az életkorral kapcsolatos patológiákkal, például csont-, immun- és motoros diszfunkcióval és veszteséggel szembeni ellenállást. az inzulinérzékenység. Az S6K1 gén expressziós mintáinak törlése hasonló a CR-ben megfigyeltekhez vagy az adenozin-monofoszfát (AMP) -aktivált protein-kináz (AMPK) farmakológiai aktiválásához, amely a CR-re adott metabolikus válasz konzervált szabályozója. A legidősebb 10% -os túlélők átlagos élettartama és a maximális élettartam szintén csak nőknél nőtt. Az S6K1 -/- és a vad típusú egerekben nem volt különbség a makroszkopikus daganatok előfordulásában.

A metformin hatásának összehasonlítása az öregedés különböző biomarkereire a különböző egeretörzsekben figyelemre méltó hasonlóságot mutat a megfigyelt mintákban. 34,35 Kimutatták, hogy a metforminnal kezelt rágcsálók testtömege és táplálékfogyasztása bizonyos életszakaszokban változatlan vagy enyhén csökkent. A testhőmérséklet hasonló volt a kontroll és a metforminnal kezelt egereknél. A metforminnak kitett 3 törzs (129/Sv, HER-2/neu és SHR) nőstényekben észlelték az öregedési funkcióban az életkorral összefüggő zavarok lelassulását. A policisztás petefészek-szindrómában szenvedő nőkhöz hasonlóan a metformin is javítja a menstruáció rendszerességét, spontán ovulációhoz vezet, és fokozza az ovuláció indukcióját klomifén-citráttal. 41

A pubertás után kezdődött metforminnal végzett kezelés nem befolyásolta a metabolikus paramétereket a 129/Sv egerekben, és javulást eredményezett a nőstény SHR és HER-2/neu egerekben. A metformin gátolta a tumorgenezist a nőstény 129/Sv és HER-2/neu egerekben, és nem befolyásolta a hím 129/Sv és a nőstény SHR egerekben. Felnőtt nőstény 129/Sv egerekben a metforminnal történő kezelés gátolta a rosszindulatú daganatok kialakulását és növelte a jóindulatú angiogén daganatok összes előfordulását. Ezek az adatok megfelelnek azoknak a megfigyeléseknek, amelyek szerint a metformin növelheti a VEGF expressziót, az intratumorális mikrovaszkuláris sűrűséget és csökkenti a nekrózist, elősegítve ezzel az angiogén fenotípust és fokozva a tumorigén progresszióját. 42

Eredményeink, valamint az mTOR jelátviteli út közelmúltbeli megállapításai az öregedés szabályozásában 44,46, valamint az emlősök rapamicin- és kalória-korlátozással járó jelentős élettartam-meghosszabbításának bizonyítékai 10,12,18,39 arra utalnak, hogy a kalóriakorlátozás utánzata, antidiabetikus biguanid A metformin gyorsan megfontolható farmakológiai beavatkozás céljából populációs szinten, figyelembe véve a gyógyszer nemét és az életkorral összefüggő sajátosságait.

Anyag és módszerek

Állatok

Minden vizsgálatot a kísérleti és egyéb tudományos célokra használt gerinces állatok védelméről szóló európai egyezmény előírásainak megfelelően terveztek és hajtottak végre. CETS 123. szám, és az N.N. Petrov Onkológiai Etikai Bizottság Kutatóintézete. A vizsgálat során az állatokat állatorvos figyelemmel kísérte a megbetegedések esetleges jelentősége szempontjából, és minden erőfeszítést megtettek a szenvedés enyhítésére. A beltenyésztett 129/Sv hím és nőstény egereket N.N. Petrov Onkológiai Kutatóintézet.

Kísérleti terv

Biokémiai paraméterek

A metabolikus paramétereket a vérszérumban értékelték. A glükózkoncentrációt elektrokémiai úton számítottuk expressz analizátorral (i-STAT, Abbot) CG8 + patronok felhasználásával. A hemoglobin (HGB) és a glikozilált hemoglobin (gHGB) koncentrációját elektroforetikusan határoztuk meg Becman Coulter, Inc. reagenskészletekkel. Az összes koleszterin-, triglicerid- és malonsav-aldehid (MDA) koncentrációt, a szuperoxid-diszmutáz (SOD) és a katalaze aktivitást Stat Fax 3300 analizátor és Spinreact reagens készletek alkalmazásával dolgoztuk fel a szokásos utasítások szerint. A háromjódin-tironin (T3), a tiroxin (T4), a vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF) és az inzulinszerű növekedési faktor (IGF-1), valamint a nitrogén-oxid (NO) koncentrációit immunenzim vizsgálattal (ELISA) értékeltük Cusabio alkalmazásával. és az R&B Systems reagenskészletek a szokásos eljárások szerint.

Patomorfológiai vizsgálat

Minden állatot boncoltak. Az összes daganatot, valamint a szövetek és szerveket, amelyeknél feltételezhető a tumor kialakulása, kivágtuk és 10% semleges formalinban rögzítettük. A szövetek rutinszerű szövettani feldolgozása után paraffinba ágyazódtak. Öt-7 μm vékony szövettani metszetet festettünk haematoxilinnal és eozinnal, és mikroszkóppal megvizsgáltuk őket. A daganatokat a Nemzetközi Rákkutató Ügynökség ajánlásai szerint osztályozták. 50

Statisztika

A kísérleti eredményeket statisztikailag variációs statisztikai módszerekkel dolgoztuk fel, a STATGRAPH statistic program kit használatával. Az eltérések jelentőségét a Student t-kritérium, a Fischer-pontos módszer (χ 2) és a nem parametrikus Wilcoxon-Mann-Whitney alapján becsültük meg. A Student-Newman-Keuls módszert alkalmaztuk az összes páronkénti többszörös összehasonlításhoz. A korrelációs együtthatót Spearman módszerrel becsültük meg. 51 A tumor előfordulásának különbségeit a Mantel-Haenszel log-rank teszttel értékeltük. A Gompertz-modell paramétereit a maximális valószínűség módszerével, a nemlineáris 52-es optimalizálási eljárással és a Matlab-ban írt saját kód segítségével becsültük meg; a paraméterek konfidencia intervallumait a bootstrap módszerrel kaptuk meg. 53

Kísérleti csoport esetében a Cox regressziós modellt 29, 63 alkalmazták a halál és a tumor kialakulásának relatív kockázatának becslésére a kezelés alatt a kontroll csoporthoz képest: h (t, z) = h0 (t) exp (zβ), ahol h (t, z) és h0 (t) a feltételes veszélyt és az alapveszélyességi arányokat jelöli, β a kezelési csoport ismeretlen paramétere, és z 0 és 1 értéket vesz fel, 2 mintának - a kontroll és a kezelési csoport - mutatója változó.

1. táblázat: Az újszülött metforminnal végzett kezelése az ösztrikus funkció paramétereire nőstény 129/Sv egerekben