A termikus ciklusos hipertermia polifenolokkal, epigallocatechin-galláttal és klorogénsavval kombinálva szinergikus rákellenes hatást fejt ki az emberi hasnyálmirigyrák PANC-1 sejtjeivel szemben

Absztrakt

Bevezetés

A hasnyálmirigyrák a rákos megbetegedések egyik vezető oka, és továbbra is világszerte az egyik leghalálosabb szilárd emberi rosszindulatú daganat [1]. A hasnyálmirigyrákban szenvedő betegeket általában visszafordíthatatlan stádiumban diagnosztizálják, és a legtöbb esetben az előrehaladott hasnyálmirigyrákban szenvedők rosszul reagálnak a kemoterápiára vagy a sugárkezelésre. Annak ellenére, hogy a terápiás módszereket fejlesztették, a hasnyálmirigyrákos betegek prognózisa továbbra is gyenge, alacsony ötéves túlélési arány mellett [2]. Ezért folyamatos kutatások szükségesek a hasnyálmirigyrák kezelésére szolgáló új szerekről vagy alternatív terápiás stratégiákról, ezáltal javítva a betegek életminőségét.

Ebben a cikkben megvizsgáltuk a TC-HT-vel kombinált EGCG vagy CGA hatásait a PANC-1 sejtek növekedési gátlására, és értékeltük a sejtciklus szabályozását, az apoptózist és a társult fehérjék expresszióját az alapmechanizmusuk tisztázása érdekében. Eredményeink azt mutatják, hogy a TC-HT-vel és az EGCG-vel vagy a CGA-val történő együttes alkalmazás a sejtciklus leállásának és a mitokondriális apoptotikus útvonal indukálásával jelentősen gátolta a sejtproliferációt és fokozta a sejthalált. Ezek a megállapítások először azt jelzik, hogy az EGCG és a CGA hatékony hő-szinergetizátor lehet, és hogy a TC-HT beadásakor a PANC-1 sejtekre gyakorolt maximális szinergetikus hatások érhetők el. Ezenkívül a TC-HT mint hőkezelés sokkal szelídebb és kivitelezhetőbb lehet, elsősorban annak a nézetnek köszönhetően, hogy a TC-HT maga viszonylag ártalmatlan a sejtekre. Úgy gondoljuk, hogy ez a tanulmány a ciklusos termikus alkalmazás érdekes koncepcióját nyújtja a rák in vitro kezelésében, és rávilágít a TC-HT mint alternatív hőkezelés lehetőségére.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra

A PANC-1 humán hasnyálmirigyrák sejtvonalat az Élelmiszeripari Kutató és Fejlesztő Intézet (Hsinchu, Tajvan) Bioresource gyűjtő és kutató központjából szereztük be. A sejteket 75 cm 3 -es sejttenyésztő lombikokba szélesztettük, és magas glükózszintű Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (DMEM) (Hyclone) 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) (Hyclone) és 1% penicillin-sztreptomicinnel (Gibco) kiegészítve tenyésztettük. párásított 5% -os CO2 inkubátor 37 ° C-on.

Gyógyszeres kezelés és TC-HT expozíció

(A) (B) A kísérlet beállításának és a TC-HT programok beállításának vázlata. (C) A PANC-1 cellákban 20 másodpercenként rögzített tényleges hőmérsékletet az expozíciós időszak alatt.

MTT assay

A sejtek életképességét 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium-bromid (MTT) (Sigma) teszttel érjük el. A sejteket 24 üregű lemezekre oltottuk és egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on. A TC-HT egyszeri hatóanyag-kezelése vagy 0,05% DMSO-val (vivőanyag-kontroll), EGCG-vel vagy CGA-val végzett 24 órás kombinált kezelése után a táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk. A sejteket ezután 0,5 mg/ml MTT-t tartalmazó DMEM-ben inkubáltuk további 4 órán át 37 ° C-on. Ezután a táptalajt eltávolítottuk és DMSO-t adtunk az formazán kristályok feloldásához. Az egyes minták felülúszóját 96 lyukú lemezekre vittük át, és az abszorbanciát 570 nm-en olvastuk le ELISA mikrolemez-olvasóval. A szinergia hányados (SQ) kiszámításakor a kombinált hatást elosztották az egyes hatások összegével □. Az adott kezelés szinergiát mutat, ha az SQ nagyobb, mint 1,0.

Klonogén túlélési vizsgálat

A PANC-1 sejteket 1000 sejt/tálcán beoltottuk 35 mm-es Petri csészékbe 24 órán át, és 0,05% DMSO-val (vivőanyag-kontroll), CGA-val, EGCG-vel és TC-HT-vel kezeltük önmagukban vagy kombinációban. A kezelés után a sejt tápközeget kicseréltük, és az edényeket párásított 5% CO2-tartalmú inkubátorban 37 ° C-on további 14 napig tenyésztettük. Végül a sejteket 4% paraformaldehiddel (PFA) (Sigma) rögzítettük 10 percig, és 0,1% kristálylilával (Sigma) festettük. Megszámoltuk a több mint 50 sejtet tartalmazó telepeket, és az egyes kezelési csoportokban a telepek számát a kontroll csoportra normalizáltuk.

Sejtciklus elemzés

A sejteket 35 mm-es Petri-csészékbe oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on. 24 órás DMSO-val (vivőanyag-kontroll), CGA, EGCG és TC-HT önmagában vagy kombinációval történő kezelése után a sejteket összegyűjtöttük, PBS-sel mostuk és 70% -os etanollal 4 ° C-on 30 percig fixáltuk. A sejteket ezután propidium-jodiddal (PI) (BD Bioscience) és RNáz A-val (Thermal Scientific) festettük 30 percig sötétben. A festett sejteket áramlási citométerrel (FACSCanto II; BD Biosciences) elemeztük a sejtciklus analízissel, és az adatokat a ModFit LT szoftverrel elemeztük.

DAPI festési vizsgálat

DAPI festést alkalmaztunk a mag morfológiai jellemzőinek kimutatására. A sejteket üveg fedőlemezeken tenyésztettük 35 mm-es Petri-csészékben. Minden 24 órás kezelés végén a sejteket kétszer PBS-sel mostuk és 4% PFA-val rögzítettük 10 percig szobahőmérsékleten. Miután kétszer mosott PBS-sel, a csatolt cellákkal ellátott üveg fedőlemezeket Fluoroshield rögzítő közeggel DAPI-val (Abcam) szereltük fel, és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk (Axio Imager A1; ZEISS).

Annexin-V/PI kettős festési vizsgálat

Az apoptózist az Annexin V-FITC/PI apoptózis detektáló készlet (BD Biosciences) segítségével határoztuk meg. Röviden: a PANC-1 sejteket TC-HT-vel kezeltük, kombinálva DMSO-val (vivőanyag-kontroll), CGA-val vagy EGCG-vel, majd a sejteket tripszin-EDTA-val (Gibco) gyűjtöttük össze, és 2000 x g-vel 5 percig centrifugálással gyűjtöttük össze., hideg PBS-sel kétszer mossuk, és az Annexin V-FITC-t és PI-t tartalmazó kötőpufferben szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziókat 15 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk, és egy FACS Calibur áramlási citométerrel elemeztük.

Mitokondrium membránpotenciál (MMP) mérése

A 0,05% DMSO-val (vivőanyag-kontroll), CGA-val, EGCG-vel és TC-HT-vel 24 órán át önmagában vagy kombinációban kezelt sejteket összegyűjtöttük, majd PBS-sel újraszuszpendáltuk, majd 20 nM DiOC6-tal (3) festettük (Enzo Life Sciences International Inc.) 30 percig 37 ° C-on, sötétben. Az alacsony MMP-t mutató sejtek frakcióját ezután áramlási citométerrel mértük.

ROS érzékelés

Sejtes reaktív oxigén fajok (ROS) szuperoxid anion (O2 • -) szintjét fluoreszcens dihidroetidium (DHE) festékkel (Sigma) detektáltuk. A sejteket a jelzett kezelésekkel kezeltük, PBS-sel mostuk, majd 5 μM DHE-vel inkubáltuk 30 percig, 37 ° C-on, sötétben. A fluoreszcencia intenzitásokat áramlási citometriával mértük, és az ROS szinteket átlagos fluoreszcencia intenzitásként (MFI) fejeztük ki.

Western blot elemzés

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± szórásként (SD) adtuk meg. Statisztikai elemzés egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) SigmaPlot szoftverrel. Az eredményeket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha a p-értékek 0,05 alatt voltak. Mindegyik kísérlet három példányban történt.