További bizonyítékok a zsírsavak étrend-kiegészítésének hatékonyságáról a szem patológiáiban: Betekintés az optikai neuritis EAE modelljéből

Filippo Locri

1 Biológiai Tanszék, Pisai Egyetem, San Zeno 31, 56127 Pisa, Olaszország; [email protected] (F.L.); [email protected] (M.C.); [email protected] (M.D.M.)

Maurizio Cammalleri

1 Biológiai Tanszék, Pisai Egyetem, San Zeno 31, 56127 Pisa, Olaszország; [email protected] (F.L.); [email protected] (M.C.); [email protected] (M.D.M.)

2 Tanszékközi Kutatóközpont Nutrafood ‘Nutraceuticals and Food for Health’, Pisai Egyetem, via del Borghetto 80, 56124 Pisa, Olaszország

Alessandro Pini

3 Kísérleti és Klinikai Orvostudományi Tanszék, Firenze Egyetem, Viale Pieraccini 6, 50139 Firenze, Olaszország; [email protected]

Massimo Dal Monte

1 Biológiai Tanszék, Pisai Egyetem, San Zeno 31, 56127 Pisa, Olaszország; [email protected] (F.L.); [email protected] (M.C.); [email protected] (M.D.M.)

2 Tanszékközi Kutatóközpont Nutrafood ‘Nutraceuticals and Food for Health’, Pisai Egyetem, via del Borghetto 80, 56124 Pisa, Olaszország

Dario Rusciano

4 Sooft Italia SpA, Contrada Molino 17, 63833 Montegiorgio (FM), Olaszország; [email protected]

Paola Bagnoli

1 Biológiai Tanszék, Pisai Egyetem, San Zeno 31, 56127 Pisa, Olaszország; [email protected] (F.L.); [email protected] (M.C.); [email protected] (M.D.M.)

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

2.2. Az EAE kiváltása

2.3. Étrend-kiegészítő

Egy korábbi tanulmánynak [5] megfelelően 9 MOG-kezelt egér és kilenc kontroll kapott orális szondával (az immunizálás napjától kezdve a 16. napig, amikor az állatokat feláldozták) telített és telítetlen FA-k keverékét, beleértve a telített FA-k, míg a telítetlen FA-k 17,5% -a. Ebből a keverékből 3,75 mg-ot 200 μl 10% -os vizes szacharóz-tartalommal szuszpendálva adtunk az állatoknak. A keverék összetételét korábban leírták [5].

2.4. A teljes RNS és fehérjék izolálása

Az egereket mélyen altattuk és méhnyak diszlokációval eutanizáltuk. A retinákat gyorsan feldarabolták és felhasználásig -80 ° C-on tárolták. Minden elemzéshez kilenc független mintát használtunk, amelyek mindegyike két egér retináját tartalmazta kísérleti körülmények között. A teljes RNS-t és a fehérjéket az AllPrep RNS/Protein Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően.

2.5. Kvantitatív valós idejű PCR

Az első szálú cDNS-t 1 μg teljes RNS-ből állítottuk elő (QuantiTect Reverse Transcription Kit, Qiagen, Valencia, CA, USA). A valós idejű PCR-amplifikációt az SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix-szel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) CFX Connect valós idejű PCR-érzékelő rendszeren és szoftver CFX manager-en végeztük (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ). qPCR primerkészletek a CXC motívum kemokin (CXCL) -10, CXCL-11, IL-12, IL-23, CC motívum kemokin (CCL) -2, CCL-22, a differenciálódási klaszter-163 (CD-163) és Az Arg-1-t úgy választottuk meg, hogy hibridizálódjon a megfelelő génszekvencia egyedi régióival (lásd a vizsgált gének és primerek teljes listáját az S1 táblázatban). Az amplifikáció hatékonysága közel 100% volt minden primer pár esetében (Opticon Monitor 3 szoftver, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). A célgéneket az Rpl13a-val egyidejűleg vizsgáltuk: az L13A riboszomális fehérjét kódoló gént. A mintákat összehasonlítottuk a relatív küszöbérték-ciklus (Ct módszer) segítségével. Az Rpl13a-ra történő normalizálódást követően a kontroll egerekhez viszonyítva határoztuk meg a növekedést vagy csökkenést (szeres változás). Az összes reakciót három példányban hajtottuk végre.

2.6. Western Blot

A 30 μg fehérjét tartalmazó mintákat SDS-PAGE-nak vetettük alá, és β-aktint használtunk terhelés kontrollként. A géleket PVDF membránra transzblotáltuk, és a blotokat 3% sovány tejben blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on az S2 táblázatban felsorolt antitestekkel. A blotokat egy órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk HRP-konjugált másodlagos antitestekkel (1: 5000) és Clarity Western fokozott kemilumineszcencia szubsztráttal (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) fejlesztettük ki, képeket szereztünk (ChemiDoc XRS +; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), és a sávok optikai sűrűségét (OD) értékeltük (Image Lab 3.0 szoftver; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Az adatokat normalizáltuk a megfelelő β-aktin OD-jára, a jelátalakítóra és a 3. transzkripció aktivátorára (STAT3) vagy az aktivált B-sejtek magfaktor kappa-könnyűlánc-fokozójára (NF-KB). Minden kísérletet két példányban hajtottunk végre.

2.7. Elektronmikroszkópia és kvantitatív elemzés

2.8. Elektroretinográfia

A teljes mező ERG-t Ganzfeld-stimulátorral (Biomedica Mangoni, Pisa, Olaszország) rögzítettük. Egy éjszakán át tartó sötét adaptáció után az egereket gyenge vörös fény alatt készítettük felvételre, és az Avertin intraperitoneális injekciójával altattuk. A tanulókat 0,5% -os atropinnal tágítottuk, a szaruhártyát időnként sóoldattal öntöztük, hogy megakadályozzuk a szemközeg homályosodását, és a testhőmérséklet 37 ° C-on tartására melegítőpárnát használtunk. Az ERG válaszokat ezüst/ezüst klorid szaruhártya elektródákon és homlok referencia elektródon keresztül rögzítettük, és egy földelt elektródot helyeztünk a farokra. Fotopikus, kúp által közvetített válaszokat rögzítettünk 10 perces fényadaptációt követően a háttérfény intenzitása 30 cd/m 2. A felvételeket 3 cd-s/m 2 fényerősség mellett kaptuk. Minden állatból 10 hullámformát regisztráltunk, és az értékeket átlagoltuk. A fotopikus negatív választ (PhNR) azonosítottuk a b hullám utáni első negatív elhajlásként, és ennek amplitúdóját kiszámítottuk az alapvonalhoz (0 μV) viszonyítva. A PhNR amplitúdó értékeit összehasonlítottuk a csoportok között.

2.9. Statisztikai analízis

Az FA-k EAE-modellben betöltött szerepét bemutató vázlatos diagram. A MOG immunválaszt indukál, amely makrofág infiltrációt eredményez. A behatoló makrofágok különböző M1 vagy M2 fenotípusokat nyerhetnek, amelyek közül az M1 gyulladásgátló citokineket termel és aktiválja a gyulladásos folyamatokat, míg az M2 szerepet játszik a gyulladás blokkolásában és elősegíti a szövetek helyreállítását. Mind az FA-k által indukált M1 fenotípus-gátlás (piros nyilak), mind az FA-k által indukált M2-fenotípus-aktiváció (zöld nyilak) egybevágnak a retina gyulladásos folyamatainak megelőzésével, ezáltal akadályozva a látóideg károsodását és a retina ganglion sejtjeinek (RGC) halálát, amelyek mindkét esetben részt vesznek az elektroretinogram (ERG) diszfunkciójának ellensúlyozására.