A σ1 és σ2 receptorok afobazol általi aktiválása növeli a gliasejtek túlélését, és megakadályozza a gliasejtek aktiválódását és a nitrozatív stresszt ischaemiás stroke után

Molekuláris Farmakológiai és Élettani Tanszék, Morsani Orvostudományi Főiskola, University of South Florida, Tampa, Florida, USA

Inbio Ventures, Moszkva, Oroszország

IBC Generium, Moszkva, Oroszország

Zakusov Farmakológiai Intézet, Moszkva, Oroszország

Inbio Ventures, Moszkva, Oroszország

Molekuláris Farmakológiai és Élettani Tanszék, Morsani Orvostudományi Főiskola, University of South Florida, Tampa, Florida, USA

Címzett levelezés és újranyomtatási kérelem Dr. Javier Cuevas-hoz, a University of South Florida Orvostudományi Főiskola Molekuláris Farmakológiai és Élettani Tanszékéhez, 12901 Bruce B. Downs Blvd., MDC-9, Tampa, FL 33612-4499, USA. E-mail: [email protected] További cikkek keresése a szerzőtől

Molekuláris Farmakológiai és Élettani Tanszék, Morsani Orvostudományi Főiskola, University of South Florida, Tampa, Florida, USA

Inbio Ventures, Moszkva, Oroszország

IBC Generium, Moszkva, Oroszország

Zakusov Farmakológiai Intézet, Moszkva, Oroszország

Inbio Ventures, Moszkva, Oroszország

Molekuláris Farmakológiai és Élettani Tanszék, Morsani Orvostudományi Főiskola, University of South Florida, Tampa, Florida, USA

Absztrakt

Használt rövidítések

Az itt bemutatott adatok azt mutatják, hogy a σ1 és σ2 receptorok afobazol-aktivációja felelős az ischaemiás stroke-ot követő megnövekedett gliasejt-túlélésért és e sejtek nyugalmi állapotban való megőrzéséért. A σ1 vagy σ2 gátlása blokkolja az afobazol hatását, jelezve, hogy mindkét vegyületre szükség van a vegyület glia-védő és gyulladáscsökkentő hatásához. Kimutatták, hogy az afobazol csökkenti a nitrozatív stresszt 96 órával a stroke után, de nem csökkenti jelentősen a TNF-α emelkedését, amely ezekben a késői időpontokban jelentkezik.

Anyagok és metódusok

MCAO műtét

Az összes állatkezelési eljárást és protokollt a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó NIH útmutató segítségével hajtották végre, amelyet a Dél-Floridai Egyetem intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyott jóvá. Felnőtt hím Sprague – Dawley patkányokat, amelyek súlya 325–375 g (Harlan, Indianapolis, IN, USA), használtuk erre a vizsgálatra. Az MCAO itt alkalmazott eljárásai megegyeztek azokkal, amelyeket korábban leírtunk (Katnik et al. 2014). Röviden: az agyi véráramlást 500 μm-es száloptikás lézeres Doppler szondával (Moor Instruments, Devon, Egyesült Királyság) és MoorLAB szoftverrel követtük nyomon. A középső agyartériát elzártuk a külső carotison keresztül behelyezett 4 cm hosszú monofil (250 μm átmérőjű) segítségével, és sikeresnek tekintettük, ha a Laser Doppler-jel ≥ 40% -kal csökkent. Az álműtéteken átesett állatokat az MCAO patkányokkal azonos módon kezelték, kivéve a monofil inszertét.

Kezelési protokollok és szövetgyűjtés

A patkányokat intraperitoneálisan injektáltuk azonos mennyiségű hordozóval (sóoldat) vagy afobazollal (3 mg/kg) napi 3x gyakorisággal, a műtét után 24 órával. Az injekciókat 3 napig folytattuk, amíg az állatokat a stroke után 96 órával leöltük. Az ál műtéti állatoknak 3 mg/kg afobazolt injektáltak. Az σ receptor antagonistákat (BD 1063, 30 mg/kg; SM-21, 1 mg/kg) csak MCAO állatokban alkalmazták, és önmagukban kontrollként vagy afobazollal (3 mg/kg) kombinációban adva 24-től kezdődően. h stroke után. Az állatokat a műtét előtt véletlenszerűen osztották be ál- vagy MCAO-műtétbe és műtét utáni kezelési csoportokba. A műtét után 96 órával az érzéstelenített állatokat bal kamrai szúrás útján perfundálták, először 0,9% sóoldattal, majd 4% paraformaldehiddel. Az agyakat eltávolítottuk, 24 órára paraformaldehidbe helyeztük, 20% és 30% szacharózban egymás után kiegyensúlyoztuk, és kriosztáton (30 μm) fagyasztva metszettük a koronális síkban.

Immunhisztokémia

Reagensek és statisztikai elemzés

A következő gyógyszereket használták: SM ‐ 21 és BD 1063 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA). Az afobazolt nagylelkűen a Masterclone biztosította. A statisztikai elemzést a SigmaPlot 11 szoftver (Systat Software, Inc., San Jose, Kalifornia, USA) alkalmazásával végeztük. A különbségeket adott esetben egy- vagy kétutas anovával, valamint a post hoc elemzés. A különbségeket jelentősnek tekintették, ha o

Eredmények

Az afobazol csökkenti az ischaemiás stroke utáni mikroglia sejtek pusztulását és aktiválódását

Kimutatták, hogy az afobazol megvédi a mikrogliát az általa kiváltott apoptózistól in vitro iszkémia (Cuevas et al. 2011b). Azt azonban nem sikerült megállapítani, hogy az afobazol képes-e csökkenteni a mikroglia sejtek pusztulását in vivo iszkémiás stroke után. Kísérleteket hajtottunk végre az afobazol hatásának meghatározására a mikroglia sejtek túlélésére a stroke után patkány MCAO modell és immunhisztokémia alkalmazásával. Az állatok ál- vagy MCAO-műtéten estek át, majd vivőanyaggal (sóoldat) vagy 3 mg/kg afobazollal injekciózták őket. Az injekciókat a műtét után 24 órával kezdték, és addig folytatták, amíg az állatokat a műtét után 96 órával fel nem áldozták. Az 1. a) ábra az anti-CD11b antitest alkalmazásával jelölt agyszelvények (Bregma -0,3) reprezentatív fotomikrográfjait mutatja. CD11b-pozitív sejteket találtunk az összes tesztelt csoportban. A több kísérletben kimutatott sejtek számának elemzése azt mutatta, hogy az egyes szakaszokban azonosított mikroglia sejtek száma az álkontrollokhoz képest az MCAO után csökkent (1b. Ábra). Az afobazol MCAO után történő alkalmazása azonban statisztikailag szignifikáns növekedést eredményezett a mikroglia számában az ipsilaterális féltekén a sóoldattal kezelt MCAO állatok összehasonlítható szakaszaihoz képest (1b. Ábra).

In vitro laboratóriumunkban végzett vizsgálatok arra is utalnak, hogy az afobazol megakadályozza a mikroglia aktiválódását iszkémiás károsodásra reagálva (Cuevas et al. 2011b). Így immunhisztokémiai kísérleteket végeztünk annak megállapítására, hogy az afobazol alkalmazása csökkenti-e a mikroglia aktiválódását 96 órával az MCAO után. Az ál-kezelt állatokban a mikroglia elsősorban az elágazó nyugalmi állapotban jelent meg (1ai. Ábra). Az MCAO-t és a kizárólag sóoldattal való kezelést követően ezen állatok ipsilaterális féltekéjén visszahúzódó folyamatokkal aktivált mikroglia volt elterjedt (1aii. Ábra). Afobazollal kezelt MCAO patkányokban az elágazó nyugalmi állapotú mikrogliákat nagyobb gyakorisággal figyelték meg, mint a sóoldattal kezelt MCAO állatokban (1aiii ábra). A mikroglia aktivációjának elemzése több kísérletben azt mutatta, hogy az ál állatokban gyakorlatilag nem volt aktivált mikroglia (1c. Ábra). Ezzel szemben körülbelül kétszer annyi mikroglia volt aktivált állapotban, mint nyugalmi állapotban a sóoldattal kezelt MCAO állatokban (1c. Ábra). Az állatok afobazollal történő injekciója (3 mg/kg) jelentősen, közel 50% -kal csökkentette az aktivált mikrogömböcske frakcióját a vivőanyaggal injektált állatokhoz képest (1c. Ábra).

Ezután kísérleteket végeztek annak felmérésére, hogy az afobazol hogyan befolyásolja az asztrociták túlélését és aktivációját az MCAO után (96 órával a műtét után). Összehasonlítottuk az aszpociták számát az ipsilaterális és kontralaterális féltekén, és GFAP jelölést alkalmaztunk e sejtek markerjeként. A GFAP-pozitív sejteket mind a színlelt, mind az MCAO patkányok ipsilaterális féltekéjén megfigyelhettük (2a. Ábra). Az MCAO-t követően a sóoldattal kezelt patkányok infarktuszónájában gyakran figyeltek meg GFAP-jelölés nélküli régiókat, de az afobazollal kezelt MCAO-állatokban a GFAP-jelölés ilyen hiánya ritkábban fordult elő (2a. Ábra). Az összesített adatok azt mutatták, hogy az ál-kezelt patkányokban összehasonlítható számú asztrocita volt az ipsilateralis és contralaterális féltekén a vizsgált régiókban (2b. Ábra). Az MCAO statisztikailag szignifikáns eredményt adott,

40% -kal csökken az asztrociták relatív száma a hordozóval kezelt állatok ipsilaterális féltekéjén (2b. Ábra). Az állatok 3 mg/kg afobazollal történő kezelése stroke után megakadályozta az asztrociták elvesztését (2b. Ábra).

Tekintettel arra, hogy az asztrociták aktiválása fokozhatja a stroke okozta sérülést (Wang et al. 2008), külön megvizsgáltuk, hogy az afobazol hogyan befolyásolta ezeknek a sejteknek az aktiválódását in vivo ischaemia. Ez fontos, mivel a 2b. Ábrán bemutatott afobazol által kiváltott citoprotekció elméletileg növelheti a reaktív asztrociták számát, és így ronthatja a stroke kimenetelét. A reaktív asztrociták a nyugalmi asztrocitákhoz viszonyítva magas GFAP-szintet fejeznek ki. Ezért ennek a markernek a szintjét használtuk a reaktív asztrociták és az asztrociták teljes számának azonosításához és összehasonlításához. A színlelt állatokban alacsony volt a reaktív asztrociták száma, az ipsilaterális és az kontralaterális aránya pedig

1. ábra, jelezve, hogy ezen állatok ipsilaterális féltekéjén nem nőtt a reaktív asztrociták száma (2b. Ábra). Az MCAO nyomán volt egy

A reaktív asztrociták számának hatszoros növekedése az ipsilaterális féltekén a sóoldattal kezelt állatok kontralaterális féltekéjéhez viszonyítva. Ez a növekedés statisztikailag szignifikáns volt (2c. Ábra). Bár az asztrocita-aktiváció felfelé történő szabályozását figyelték meg az afobazollal kezelt MCAO-állatokban, ez a növekedés statisztikailag kisebb volt, mint a hordozóval kezelt patkányoknál (2c. Ábra).

40% -kal csökken a mikroglia aktivációja a sóoldathoz képest (4b. Ábra). Amikor azonban a BD 1063-at vagy az SM ‐ 21-et együtt alkalmazták, az afobazolnak nem volt szignifikáns hatása a mikroglia aktiválására (4b. Ábra).

Ezután kísérleteket hajtottak végre annak megállapítására, hogy az afobazol csökkenti-e az ischaemiás stroke-ot követő nitrozatív stresszt. Ezeket a kísérleteket az a tény motiválta, hogy a nitrozatív stressz jól bevált, mint kulcsfontosságú sérülésközvetítő a stroke-ban, és az a megfigyelés, hogy az σ receptor aktivációja csökkentheti az ischaemiás stroke utáni NO-termelést (Goyagi et al. 2001). A TNF-α-hoz hasonlóan az ál agyakban is nagyon alacsony SNOC-szintet detektáltak mind az ellenoldali, mind az ipsilaterális féltekén, mindkét félteke szintje összehasonlítható (5b. Ábra). Az MCAO nyomán kifejezett volt,

Az SNOC sejtjelzésének ötszörös növekedése sóoldattal kezelt állatokban. Ugyanakkor az SNOC szintje> 60% -kal csökkent, amikor az afobazolt az MCAO után alkalmazták, és ez a csökkenés statisztikailag szignifikáns volt (5b. Ábra). Így az afobazol az iszkémiás stroke után csökkenti a nitrozilezést, ami valószínűleg csökkenti a sejtek károsodását. Míg az afobazol csökkenti a nitrozatív stresszt, az oxidatív stressz változását nem mutatták ki, amelyet az oxidatív DNS károsodása jelez, 96 órával a stroke után (S1b ábra).

90% a megfelelő kontrollhoz képest (azaz MCAO BD 1063-mal és MCAO SM-1-rel) (6c. Ábra).

Vita

Az itt közölt fő megállapítás az, hogy az σ agonista, az afobazol, csökkenti a gliasejtek aktiválódását és növeli ezeknek a sejteknek a túlélését, ha késleltetett időpontokban alkalmazzák az ischaemiás stroke MCAO patkány modelljében. A mikroglia és az asztrociták száma 96 órával nőtt az ischaemiás sértés után 3 mg/kg afobazollal kezelt MCAO állatok ipsilaterális féltekéjében a műtét után 24 órával. Ezenkívül az afobazol hozzáadása nagyobb számú mikrogliát tartott fenn nyugalmi állapotban, megbomlott állapotban, és csökkentette a magas GFAP-szintet expresszáló reaktív asztrociták számát. Az afobazol asztrocitákra és mikrogliákra gyakorolt hatását gátolta az σ1 antagonista, a BD 1063 vagy az σ2 antagonista, az SM ‐ 21 együttes alkalmazása, jelezve, hogy mindkét σ receptor altípus aktiválása szükséges az afobazol hatásához. Ezenkívül azt találták, hogy az afobazol csökkenti a fehérjék nitrozilációját, de nem csökkentette a gyulladásos citokin, a TNF-α szintjét, 96 órával a stroke után.

A mikroglia sejtek túlélésének növelése mellett az afobazol alkalmazása 24 órával a stroke után jelentősen csökkentette ezen sejtek aktiválódását 96 órával a műtét után. A mikroglia aktivációja ismert, hogy az iszkémiás károsodás fő tényezője, és ennek a folyamatnak a gátlása ismerten csökkenti a stroke károsodását (Giulian és Vaca 1993; Yrjanheikki et al. 1998; Lee et al. 2005). Az előrejelzések szerint tehát az afobazol által okozott mikroglia aktiváció csökkenése javítja a stroke kimenetelét. In vitro kísérletek korábban bebizonyították, hogy az afobazol blokkolja a mikroglia sejtek aktiválódását, amit az ATP-re adott válaszként a membrán fodrosodásának és a sejtek migrációjának csökkenése mutat (Cuevas et al. 2011b). Laboratóriumunk korábban kimutatta, hogy a σ receptor agonista, a DTG csökkenti a mikroglia aktiválódását in vitro és követi az MCAO-t (Ajmo et al. 2006; előszoba et al. 2009). Ezzel szemben az σ1 ligandum, az SA4503, nem képes megakadályozni az ischaemiás stroke-ot követő mikroglia sejtek aktiválódását (Ruscher et al. 2012).

50%. Ez megmagyarázhatja, hogy a stroke utáni korábbi idõpontokban, a gliasejtek pusztulása elõtt, miért csökkentette a TNF-α szinteket a P α-receptorok általi aktiválás.

Összegzésképpen elmondható, hogy a σ1 és σ2 receptorok együttes aktiválása az afobazollal a mikroglia és az asztrociták túlélésének növekedését eredményezi, és patkányokban ischaemiás stroke-ot követően csökkenti a reaktív gliasejtek számát. Az afobazol hatása mindkét receptor altípus aktiválódásától függ, és bármelyik receptor gátlása jelentősen tompítja ennek a gyógyszernek a hatását. A glia védelem és a csökkent reaktivitás akkor fordul elő, amikor az afobazol alkalmazását a stroke után 24 órával kezdik meg, ami azt jelzi, hogy az afobazol hatékonyan kibővítheti a stroke kezelés terápiás ablakát. Az afobazol a σ1 és σ2 receptorok aktiválásával csökkenti a nitrozatív stresszt is, ami valószínűleg előnyöket jelent a stroke után. Úgy tűnik azonban, hogy az afobazol nem befolyásolja a TNF ‐ α, az IL ‐ 10 szintet vagy az oxidatív DNS károsodását a stroke után 96 órával. Összefoglalva, eredményeink betekintést engednek azokba a molekuláris mechanizmusokba, amelyek révén az afobazol késedelmes időpontokban védelmet nyújt a stroke okozta sérülésektől, és azt sugallják továbbá, hogy az afobazol jelentős potenciállal rendelkezik az embereknél a stroke terápia új szereként.

Köszönetnyilvánítás és összeférhetetlenségről szóló tájékoztatás

Köszönjük Nivia Cuevasnak, R.Ph.-nek a kézirat tervezetéhez fűzött észrevételeket, és Gabriel A. Cuevasnak az SNOC immunhisztokémiai kísérleteihez nyújtott segítséget. Ezt a kéziratot az IBC Generium a JC-nek nyújtott támogatásokkal támogatta. Nincsenek összeférhetetlenségi jelentések az itt bemutatott munka szempontjából.

Valamennyi kísérletet az ARRIVE irányelveknek megfelelően végeztük.