Étrend-kiegészítése Bacillus subtilis befolyásolta a kórokozóval kísérletileg fertőzött elválasztott sertések bél egészségét E. coli

Absztrakt

Háttér

Egyre több bizonyíték támasztja alá a közvetlenül táplált mikrobák (DFM) kiegészítésének az elválasztott sertések teljesítményére, egészségi állapotára és immunválaszaira gyakorolt ​​jótékony hatásait. Ezért ennek a tanulmánynak a célja az étrend-kiegészítők vizsgálata volt Bacillus subtilis (DSM 25841) a patogén F-18-mal kísérletileg fertőzött elválasztott sertések növekedési teljesítményéről, hasmenéséről, bélpermeabilitásáról és immunitásáról Escherichia coli (E. coli).

Eredmények

Az F18 E. coli fertőzés csökkent (P

Háttér

Az elválasztás utáni hasmenés óriási gazdasági veszteségeket okoz a sertésiparban a halálozás és morbiditás, a fogyás és a gyógyszerköltség miatt [1, 2]. Enterotoxigén Escherichia coli (E. coli) a fertőzés továbbra is az elválasztás utáni hasmenés egyik legfontosabb oka a sertésekben. Az elmúlt évtizedekben az antibiotikumokat erőteljes összetevőként alkalmazták az elválasztás utáni hasmenés megelőzésére E. coli fertőzés. A takarmányokban lévő antibiotikumok termelési célú felhasználását azonban az állattenyésztési iparban teljesen megtiltották az USA-ban és az EU-ban [3], ami jelentősen növeli a sertések egészségének megőrzésével járó kihívásokat, különösen az elválasztás utáni időszakban. Így minden olyan megbízható stratégia, amely növelheti a betegségekkel szembeni ellenállást és az elválasztott sertések termelését, jelentős előnyökkel jár az ipar számára [4, 5].

Anyagok és metódusok

Állatok, szállás, kísérleti tervezés és étrend

Klinikai megfigyelések és mintagyűjtések

Β-hemolitikus coliformok kimutatása

Röviden: székletmintákat vittünk a Columbia Blood Agar-ra 5% juhvérrel, hogy azonosítsuk a hemolitikus coliformokat, amelyek lizálják a kolóniát körülvevő vörösvérsejteket. Székletmintákat is telepítettünk MacConkey agarra az összes coliform felsorolásához. A véragar hemolitikus telepeit MacConkey-agaron tovább tenyésztettük, hogy megerősítsük, hogy laktózt fermentáló baktériumok és lapos rózsaszínű telepek voltak. Az összes lemezt 37 ° C-on inkubáltuk 24 órán át egy levegő-inkubátorban. Mind a teljes, mind a β-hemolitikus koliformok populációit a véragaron vizuálisan értékeltük, 0 és 8 közötti pontszámmal (0 = nincs baktériumnövekedés, 8 = nagyon nehéz baktériumnövekedés). Kiszámítottuk a β-hemolitikus coliformok és az összes coliformok arányát. A kérdéses telepeket új MacConkey és véragar lemezeken szubkultúrázták, hogy ellenőrizzék, β-hemolitikusak-e E. coli hármas cukor-vas-agar és lizin-vas-agar használatával, és annak igazolására, hogy ezek F-18-at tartalmaznak-e+ E. coli PCR alkalmazásával [21].

Béláteresztés elemzése Ussing kamrával

A bélpermeabilitás elemzésének eljárásai a korábban publikált módszereket követték [22]. A szöveteket egy Ussing kamrába (Physiological Instruments, San Diego, Kalifornia) szereltük fel, miután a hosszanti izomtól megfosztották és a mesenterialis határ mentén kinyitották. A kamra a szövet felületét (0,5 cm2) 2,5 ml oxigénezett Krebs-mannitol (10 mmol/l) és Krebs-glükóz (10 mmol/l) hatásának tette ki 37 ° C-on, a luminális és a szerozális oldalon. 30 perces egyensúlyi periódus után mértük a rövidzárlati áramot és a vezetőképességet. A transzcelluláris és a paracelluláris permeabilitást a torma-peroxidáz (HRP) és a FITC-4000 (FD-4) fluxusának mérésével határoztuk meg a jejunális nyálkahártyán. HRP-t (0,5 mg) és FD-4-et (1 mg) adtunk a nyálkahártya kamrájához, és 200 µL mintát gyűjtöttünk a szerosális kamrából 30 percenként 1 órán át. A kamrákon belüli állandó térfogat fenntartása érdekében minden mintapontban ekvivalens térfogatú Krebs-glükóz-oldatot cseréltek ki. O-dianizidin-peroxidáz szubsztrátumot használtunk a HRP detektálására 450 nm abszorbanciánál. Az FD-4 koncentrációját fluoreszcenciával mértük 485 nm gerjesztésnél és 538 nm emissziónál.

A bél morfológiája

A rögzített bélszöveteket paraffinba ágyazottuk, 5 μm-nél metszettük, és magas vas-diaminnal és alcian-kékkel festettük. A tárgylemezeket a NanoZoomer Digital Pathology System (Hamamatsu Co., Bridgewater, NJ) szkennelte, és az összes mérést a hozzá tartozó dia-néző szoftverrel (NDP.view; Hamamatsu Co.) és képfeldolgozó és elemző szoftverrel (Image J, NIH, NEMZETI EGÉSZSÉGÜGYI INTÉZET). Tizenöt egyenes és integrált villit és a hozzájuk tartozó kriptákat és a körülvett területet választottuk ki a villi magasságának, a kriptamélységének, a villára jutó serlegsejtek számának és a szulfo- és szialomucin keresztmetszeti területének elemzésére, amint azt Deplancke és Gaskins leírják [23] és Almeida és mtsai. [19].

Kvantitatív valós idejű PCR

Statisztikai analízis

Az adatok normalitását az UNIVARIATE eljárás segítségével (SAS Inst. Inc., Cary, NC) azonosítottuk és a bélpermeabilitásra és a hasmenés gyakoriságára várható összes adatot kiszámítottuk. Ugyanakkor nem észleltek kiugrást és nem távolítottak el az adatkészletből. A növekedési teljesítmény, a hasmenés pontszám, a bélpermeabilitás és a génexpresszió szempontjából az adatokat ANOVA-val elemeztük, a SAS PROC MIXED alkalmazásával, randomizált, teljes blokktervezéssel, disznóval mint kísérleti egységgel. A statisztikai modell a kezelést szerepeltette fő hatásként, a blokkokat pedig véletlenszerű hatásként. A kezelési eszközöket az LSMEANS utasítás és a PROC MIXED PDIFF opciójának felhasználásával választottuk el. Kontraszt állításokkal teszteltük a Bacillus subtilis összehasonlítva a pozitív kontrollal. A hasi gyakoriság elemzésére a khi-négyzet tesztet használtuk. A statisztikai szignifikanciát és tendenciát a P

Eredmények

Növekedési teljesítmény, hasmenés pontszám, β-hemolitikus coliformok

A sertések kezdeti testtömegében nem tapasztaltunk különbséget az étrendi kezelések között (2. táblázat). A negatív kontroll sertésekkel összehasonlítva a pozitív kontroll csoport sertései csökkentették a BW értéket a d 5 PI-n (P 2. táblázat Az elválasztott sertések növekedési teljesítménye kiegészítve Bacillus subtilis

A negatív kontrollhoz képest F18 E. coli kihívás nőtt (P 1. ábra

sertések

A negatív kontrollcsoport sertéseinek székletében nem észleltünk β-hemolitikus coliformokat (2. ábra). Sertések a pozitív kontrollban, alacsony és nagy dózisban Bacillus subtilis csoportban magasabb volt (P 2. ábra

Béláteresztés és bélmorfológia

F18 E. coli kihívás nőtt (P 3. ábra

E. coli a kihívás is csökkent (P 4. táblázat A gének relatív mRNS-expressziója az elválasztott sertések jejunális nyálkahártyájában Bacillus subtilis

E. coli szabályozott kihívás (P 5. táblázat A gének relatív mRNS-expressziója az elválasztott sertések ileum nyálkahártyájában, kiegészítve Bacillus subtilis

Vita

F18 E. coli-az indukált hasmenés az elválasztott sertések morbiditásának és mortalitásának gyakori oka [26]. A jelenlegi tanulmányban feltárt eredmények azt mutatják, hogy a Bacillus subtilis javult növekedési sebesség, csökkent béláteresztés és módosíthatja az F18-mal kísérletileg fertőzött elválasztott sertések bélrendszerét E. coli. Ezek az eredmények összhangban vannak a korábban publikált kutatásokkal, amelyek a különböző törzsekkel táplált malacok növekedési teljesítményének és egészségi állapotának javulását mutatják Bacillus subtilis [27,28,29]. Az ezekhez az előnyökhöz kapcsolódó lehetséges mechanizmusok a következőket tartalmazhatják, de nem korlátozódnak ezekre: 1) a Bacillus subtilis (DSM 25841) javította a bél integritását azáltal, hogy fokozza a bélgát funkcióját és csökkenti a bél áteresztőképességét a jejunumban; 2) kiegészítése Bacillus subtilis az elválasztott sertések szabályozott bélimmunitása; 3) a Bacillus subtilis modulálta a bél mikrobiomját és metabolitjaikat. A mostani kísérlet inkább az első potenciális mechanizmusra koncentrált.

A sok potenciális jelölt egyikeként, hogy részben pótolja a takarmányban lévő antibiotikumokat, Bacillus subtilis sok figyelmet keltettek, mivel hőstabilak a takarmány feldolgozása során, és képesek átadni potenciális előnyeiket a vékonybélben/vastagbélben, miután túlélik a gyomorban alacsony pH-értéket [5]. A bejelentett hatásai Bacillus subtilis az elválasztott sertések hasmenésének előfordulásáról nem következetesek. Példaként Bhandari et al. [37] és Hu és mtsai. [15] feltárta, hogy Bacillus subtilis csökkent az elválasztott sertések hasmenése akár egy K88-ban E. coli kihívástanulmány vagy normál lakhatási körülmények között, de ez nem volt így a Giang et al. [38]. Bár kiegészítése Bacillus subtilis nem csökkentette a hasmenés gyakoriságát E. coli A jelen vizsgálatban a disznókkal fertőzött sertéseket ezután fokozta az elválasztott sertések növekedési ütemét és takarmányhatékonyságát E. coli fertőzés. Ezek a megfigyelések egyértelműen jelzik a Bacillus subtilis elősegítette az elválasztott sertés teljesítményét valószínűleg más mechanizmusok révén. Utánkövetési kísérlet folyik a bélpermeabilitás és az általános hasmenés pontszám közötti összefüggés feltárására további mintavételi pontok hozzáadásával és a kísérleti időszak meghosszabbításával.

Más potenciális mechanizmusok is kapcsolódhatnak a táplálékkal megnövekedett növekedési sebességhez Bacillus subtilis. Mint például, Bacilus-alapú DFM javíthatja az elválasztott sertések növekedési teljesítményét az energia és a tápanyagok emészthetőségének javításával [29, 54]. Különösen, Bacilus-alapú DFM növelheti a rostbontást a sertések bélrendszerében [11, 55]. Bacilus-az alapuló DFM-kiegészítés szintén növelheti a bélrendszerben található hasznos mikroorganizmusok populációját, amelyek versenyeztetik a tápanyagokat és a kötődési helyeket a kórokozókkal, ezáltal csökkentve a kórokozók szaporodását [56]. További kutatások szükségesek az itt felsorolt ​​lehetséges hatásmódok vizsgálatához.

Következtetés