A BecR-1 miR-384-5p által közvetített kontrollja által szabályozott makrofág autofágia szerepet játszik az érelmeszesedés kialakulásában

Beiyun Wang

1 Gerontológiai Osztály, Sanghaji Hatodik Népi Kórház, amely a Sanghaji Jiaotong Egyetemhez tartozik, 600 Yishan Road, Sanghaj 200233, Kína

Yuan Zhong

1 Gerontológiai Osztály, Sanghaji Hatodik Népi Kórház, amely a Sanghaji Jiaotong Egyetemhez tartozik, 600 Yishan Road, Sanghaj 200233, Kína

Dong Huang

2 Kardiológiai Osztály, Sanghaji Hatodik Népi Kórház, amely a Sanghaji Jiaotong Egyetemhez tartozik, 600 Yishan Road, Sanghaj 200233, Kína

Jingbo Li

2 Kardiológiai Osztály, Sanghaji Hatodik Népi Kórház, amely a Sanghaji Jiaotong Egyetemhez tartozik, 600 Yishan Road, Sanghaj 200233, Kína

Absztrakt

Bevezetés

Az ateroszklerózis legfontosabb kóros eseményei a krónikus gyulladás okozta lipidek és rostos elemek lerakódása az artériás fal nagy és közepes artériáiban. Az érelmeszesedés az elsődleges oka a szívbetegségnek és a szélütésnek, amely sok ember halálát okozza. Az érelmeszesedés egy rosszul adaptív gyulladásos válaszból adódik, amelyet a koleszterinben gazdag, apolipoprotein B-t tartalmazó lipoproteinek intramurális retenciója indít el az artériás érrendszer érzékeny területein [1,2]. Az Apolipoprotein E (ApoE) az ateroszklerózis jól ismert erős szuppresszora, amelyben nemcsak szabályozza a lipoprotein koleszterin transzportját és szabályozza a sejtek lipid szabályozását, hanem gátolja a gyulladás előfordulását is [3,4]. Ezen elképzeléssel összhangban az ApoE-hiányos (ApoE -/-) egerek fokozott krónikus gyulladást mutatnak a hiperkoleszterinémia hatására, és fokozott akut immunválaszt a bakteriális lipopoliszacharid (LPS) esetén [3-9]. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) 12 hét alatt érelmeszesedés kialakulását idézi elő ApoE -/- egerekben, amelyet modellként alkalmaztak kísérleti érelmeszesedéshez [10-12].

Az autofágia egy katabolikus út, amely lebontja és újrafeldolgozza a sejtrekeszeket a sejtek túlélése érdekében különböző stresszek esetén, míg meghibásodása gyakran sejthalálhoz vezet [13]. A mikrotubulusokhoz társult 1A/1B-könnyűlánc 3 (LC3) oldható sejtfehérje. Az autofágia során az autofagoszómák elnyelik a citoplazmatikus komponenseket, ami az LC3 citoszolos formájának (LC3-I) konjugációját eredményezi foszfatidil-etanol-aminnal, LC3-foszfatidil-etanol-amin konjugátum (LC3-II) képződésével. Így az LC3-II és az LC3-I aránya az autofág aktivitást képviseli [13-15]. Az autofágia-asszociált fehérje 6 (Atg6 vagy Beclin-1), az ATG7 és a p62 számos kulcsfontosságú autofágia-társított fehérje, amely független vagy összehangolt módon erősen indukálja az autofágiát [16].

Az artériás falban leválasztott lipoproteinek hajlamosak különféle módosításokra, amelyek ezeket a részecskéket gyulladásgá teszik, és amelyek a fedő endotélsejtek aktivációját indukálják. Az ezt követő immunválaszt közvetíti a monocitákból származó sejtek toborzása a szub endotheliális térbe, ahol makrofágokká differenciálódnak, amelyek lenyelik a lerakódott lipoproteineket, majd átalakulnak koleszterinnel teli habsejtekké. A jellemzően a makrofágok egyikébe sorolt habsejtek megmaradnak a plakkokban, ami elősegíti a betegség progresszióját. Ezért a makrofágok kulcsszerepet játszanak az érelmeszesedés kialakulásában [17-20].

Ennek ellenére hiányzik az atherosclerosis kialakulásában a makrofágok autofágia szabályozását megalapozó molekuláris mechanizmusok vizsgálata.

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) kicsi, nem kódoló RNS-ek, amelyek a fehérje transzlációját a cél mRNS-ek 3’-nem-transzlált régiójával (3’-UTR) való bázispárosításuk révén szabályozzák [21-27]. A MiRNA-k alapvető szerepet játszanak az érelmeszesedés szabályozásában [5,28,29]. Az összes miRNS közül a miR-384-5p csak nemrégiben mutatott szerepet az idegrendszer működésében [30,31]. Ennek ellenére nem számoltak be a miR-384-5p szerepéről az érelmeszesedésben.

A jelenlegi tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) kezelt ApoE (-/-) egereknél 12 hét alatt ateroszklerózis alakult ki, míg a kontroll ApoE (-/-) egerekben, akik normál étrendet kaptak (egyszerűsítve NOR néven). egerek) nem. A NOR egerekhez képest a HFD egereknél szignifikánsan több volt a makrofág pusztulás és szignifikánsan alacsonyabb a makrofág autofágia, ami a Beclin-1 csökkenésének következménye. Ezenkívül a Beclin-1 csökkenése a makrofágokban a HFD által kiváltott miR-384-5p növekedésnek volt köszönhető, amely elnyomta a Beclin-1 mRNS transzlációját 3'-UTR kötés révén.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

A tanulmányt a Sanghaji Jiaotong Egyetemhez tartozó Sanghaji Hatodik Népkórház Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. Valamennyi kísérleti eljárást az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete által kiadott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató szerint hajtották végre. Valamennyi kísérletet a létesítmény intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságának felügyelete alatt hajtották végre az intézményi állatgondozási és felhasználási bizottság által jóváhagyott protokoll szerint.

Egér érelmeszesedés modell

Nyolc hetes hím ApoE (-/-) egereket a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME, USA) vásároltak, vagy házon tenyésztettek, és steril körülmények között, valamint standard állatszobai körülmények között (hőmérséklet, 21 ± 1 ° C; nedvességtartalom, 55-60%). Az állatokat véletlenszerűen két csoportra osztottuk: a normál étrendű csoportra (NOR) és a magas zsírtartalmú étrendre (HFD). A HFD csoportba tartozó állatokat 12 hétig tartottuk ateroszklerózis kiváltására, majd az aortákat kivágtuk az egerekből. Az aorta gyökereket a szív bazális részével együtt 4% paraformaldehiddel rögzítettük 4 órán át, krio-védelemmel 30% szacharózban 12 órán át, majd OCT vegyületbe ágyazottuk. A szövetet 6 μm vastagságú metszetekre kereszteztük. Az aorta gyökér ateroszklerotikus elváltozásait H&E festéssel vizsgáltuk. Olajvörös O festést a gyártó utasításai szerint végeztünk, hogy bemutassuk a lipid lerakódását egy olajvörös O festő készletgel (Abcam, Cambridge, MA, USA). A képek számszerűsítését NIH ImageJ szoftverrel (Bethesda, MD, USA) mértük. Az adatokat minden csoportra 10 egérből számoltuk. Mindegyik egér esetében 3 tárgylemezt használtunk, amelyek 50 µm-re voltak egymástól.

Makrofág transzfekció

Az elsődleges egér makrofágok tenyésztő táptalajai DMEM táptalajok (Invitrogen, CA, Carlsbad, USA), kiegészítve endothelsejt-növekedési faktorokkal, 5% marha-magzati szérummal (FBS, Invitrogen) és 1% penicillin/sztreptomicinnel (Invitrogen). A sejteket 37 ° C-on tartottuk 5% CO2-tartalommal. A makrofágokat miR-384-5p utánzatokkal, antiszenszekkel miR-384-5p (as-miR-384-5p) vagy nullkontrollokkal (RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, Guangdong, Kína), Lipofectamine 2000 reagens ( Invitrogen), a gyártó utasításainak megfelelően. A transzfekciós hatékonyság közel 100% volt.

Apoptózisvizsgálat és áramlási citometria

A tenyésztett sejteket 106 sejt/ml sűrűségben PBS-ben szuszpendáltuk. FITC-Annexin V-vel és propidium-jodiddal (PI) végzett kettős festés után egy FITC Annexin V Apoptózis Detection Kit I-ből (Becton-Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) a sejteket FACScan áramlási citométerrel (Becton-Dickinson Biosciences) elemeztük. az Annexin V + PI-apoptotikus sejtek meghatározására Flowjo szoftverrel (Flowjo LLC, Ashland, OR, USA). Az F4/80 + sejtek elemzéséhez és izolálásához az aortát 10 μg/ml tripszinnel (Sigma-Aldrich) és 10 μg/ml DNázzal (Roche, Nutley, NJ, USA) 35 percig disszociáltuk. 30 μm-es szűrés után az egér aortájából származó egyetlen sejtet emésztettük PE-cy7-F4/80-tal (Becton-Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) inkubáltuk, majd a FACScan áramlási citométeren válogattuk.

Valós idejű RT-PCR

Aorta intim RNS-t izoláltunk egér aortákból. Jéghideg PBS-sel történő tisztítás után az egér aortákat inzulinfecskendő segítségével TRIzol reagenssel (Invitrogen) öblítettük, és az eluátumot 1,5 ml-es csőbe gyűjtöttük, és RNS-extrakcióra előkészítettük. A teljes RNS-t szövetből vagy tenyésztett sejtekből extraháltuk miRNeasy mini kit segítségével (Qiagen, Hilden, Németország). A komplementer DNS-t (cDNS) véletlenszerűen alapoztuk meg 2 μg teljes RNS-ből nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Az RT-qPCR-t ezt követően három példányban, QuantiTect SYBR Green PCR Kit-lel (Qiagen) végeztük. Az összes primert a Qiagen-től szereztük be. Az adatokat összegyűjtöttük és elemeztük 2-ΔΔCt módszerrel a relatív mRNS expressziós szintek kvantifikálásához. A gének értékét először normalizáltuk az a-tubulinnal szemben, majd összehasonlítottuk a kísérleti kontrollokkal.

Western blottolás

A sejteket proteáz és foszfatáz inhibitorokat tartalmazó RIPA pufferrel (cOmplete ULTRA Tablets, Roche, Nutley, NJ, USA) lizáltuk. Centrifugálás után a felülúszót összegyűjtöttük és mennyiségileg meghatároztuk. Ezután a fehérjéket SDS-PAGE-val elválasztottuk és nitrocellulóz membránokra vittük át. 5% zsírmentes tejjel történő blokkolás után a membránokat nyúl anti-p62, nyúl anti-LC3, nyúl-anti-Beclin-1, nyúl-anti-ATG7 és nyúl-anti-α-tubulinnal vizsgáltuk (Cell Signaling Technology). (Danvers, MA, USA). A másodlagos antitesteket HRP-konjugációban mutatjuk be patkány vagy nyúl ellen (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, USA). A fehérjeszinteket először a-tubulinra normalizálták, majd a kísérleti kontrollokra normalizálták. A Western-blotok denzitometriáját NIH ImageJ szoftverrel számszerűsítettük.