A bél dysbiosisának elnyomása megfordítja a nyugati étrend által kiváltott érrendszeri diszfunkciót

Élelmiszertudományi és emberi táplálkozási tanszék, Colorado Állami Egyetem, Fort Collins, Colorado

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezések címe: C. L. Gentile, Élelmiszertudományi és emberi táplálkozási osztály, Colorado State Univ., Fort Collins, CO 80524 (e-mail: [email protected]).

Absztrakt

Mikrobiota jellemzés.

A széklet anyagát a befejezéskor összegyűjtöttük, és a DNS-t a PureLink Microbiome DNS Purification Kit (A29790, Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával extraháltuk. Kvantitatív PCR-t használtunk a mikrobiota szuppressziójának igazolására Abx-kezelt állatokban. A reakciókat optimalizáltuk a 16s rRNS-génre univerzális baktérium-primerek (előre 5'-AAACTCAAAKGAATTGACGG-3 ', fordított 5'-CTCACRRACACGAGCTGA-3') felhasználásával (2). A kerékpáros körülmények a Bio-Rad CFX96 hőkerékpárral a következők voltak: 95 ° C 3 percig, majd 40 ciklus 95 ° C 15 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C 10 s, 85 ° C 5 s, majd fluoreszcencia detektálás.

A páros végű szekvenáló könyvtárakat az Illumina 16s protokoll követésével állítottuk össze, amely magában foglalja a 16s rRNS gén V3 – V4 régióinak amplifikálását, amplikonok tisztítását AmPure gyöngyökkel, ligálást Illumina adapterekkel és kettős indexekkel, majd egy újabb kör AmPure gyöngyöt tisztítás, mennyiségi meghatározás, denaturálás és könyvtárgyűjtés, valamint szekvenálás egy Illumina MiSeq-en. A párosított fastq fájlokat az alapértelmezett myPhyloDB ver használatával állítottuk össze és dolgoztuk fel. 1.2.0 szekvenáló pipeline (45), amely a mothur bioinformatikai szoftvert használja a szekvencia feldolgozásához (57). Röviden, a szekvenciákat átvilágítottuk (maxhomop = 0, maxambig = 1), kimérákat távolítottunk el, és a Green-Genes ver-ben a K-mer alapú legközelebbi szomszédhoz (KNN) soroltuk. 13_5 referencia adatbázis. A feldolgozás befejezése után az adatokat ritkítással normalizáltuk, a minimális mintaméret 165 872 olvasás alapján. Ötszáz független normalizálási futtatást hajtottak végre, és a további elemzések során az összes normalizálási futtatás átlagos bőségét használtuk.

Keringő analitok.

Az inzulin, a leptin és a gyulladásos citokinek, az interleukin-6 (IL-6), a monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) és a plazminogén aktivátor inhibitor-1 (PAI-1) plazmaszintjét multiplex vizsgálat (MADKMAG- 71K, EMD Millipore, Billerica, MA). Vizsgálaton belüli variabilitás (3 (UVP, Upland, CA) képalkotó rendszerek, és az adatok az SD-hez viszonyított változásokként vannak feltüntetve.

Glükóz tolerancia teszt.

Nál nél 5. hónap étrenden és 1 hét múlva a kísérlet befejezése előtt az egereket 6 órán keresztül éheztettük, és a vércukorszintet farok-vénás vérből határoztuk meg AlphaTRAK 2 glükózmérővel (Abbott Laboratories, Chicago, IL). Az egerek intraperitoneális injekciót kaptak 2 g/kg dextrózról, és a vércukorszintet 0., 15., 30., 60. és 120. percben értékeltük az injekció beadása után.

Statisztika.

Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, Tukey post hoc tesztjével végeztük (SPSS for Windows, 11.5.0 kiadás; SPSS, Chicago, IL). Vegyes modellű ANOVA-t (faktoron, időn vagy dózison belül; faktor, kezelési csoport között) használtunk az aPWV, valamint az EDD és az EID dózis-válasz görbékhez. Amikor jelentős fő hatást észleltek, Tukey post hoc tesztjét végezték el a specifikus páros különbségek meghatározására. A P értéke

1. ábra.Az antibiotikum-kezelés elnyomja a bél mikrobiotáját a nyugati étrend által kiváltott dysbiosis után. A: a baktériumok számának változásai a standard étrend (SD), a nyugati étrend (WD) és a WD után antibiotikummal (Abx). B: vakbéltömeg WD és antibiotikus kezelést követően. C: fő komponens-analízis (PCA) egér bélsár mikrobiális közösségének táplálékkal színezett (zárt körök = WD; nyitott körök = SD) színezése, és az egyes kvadránsokban a variabilitást előidéző baktériumfajok feltüntetése. D: szignifikánsan differenciálisan bőséges baktérium taxonok hisztogramma WD-ben az SD-hez képest (q = 0,05) log log-változásként jelenik meg. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, Tukey post hoc tesztjével végeztük. Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki; n = 10–12/csoport. *P

A nyugati étrend jelentős változásokat eredményezett a bél mikrobiotájában. Például az SD-hez képest a WD-n lévő állatok szignifikánsan megnövelt Firmicutes értéket mutatnak (SD = 49,755; WD = 109,454; P = 0,0002) és csökkent Bacteroidetes (SD = 21 907; WD = 11 205; P = 0,016) és az aktinobaktériumok (SD = 94,082; WD = 45,210; P = 0,003). A PCA-elemzés kimutatta a minta csoportosítását étrendtípusonként a PC1 mentén, a szétválasztást az vezérelte Ruminococcus gnavus WD-hez és többhez Bifidobacterium spp. SD-re (1. ábraC). Az étrend számos baktérium taxon bőségét változtatta meg; különösen, Bifidobacterium spp. szignifikánsan nagyobb mennyiségben voltak SD állatokban a WD-vel összehasonlítva (1. ábraD).

Az artériás merevség fokozatosan nőtt a WD egerekben a 7 hónapos beavatkozás során. Antibiotikum-kezelésben részesített, WD-vel táplált egerekben (WD + Abx) az artériás merevség teljesen normalizálódott SD-szintre (2. ábraA). Hasonlóképpen, az aorta közeg vastagsága megnőtt a WD-ben az SD egerekhez képest, és normalizálódott a WD + Abx-ben (2. ábraB). Nem figyeltünk meg csoportkülönbségeket a passzív luminal átmérőnél (SD 161,7 ± 7,4, WD 170,8 ± 6,7, WD + Abx 174,9 ± 8,5 µm) vagy a fenilefrin által kiváltott preconstrikciónál (SD 56,6 ± 5,5, WD 59,0 ± 4,3, WD + Abx 59,9 ± 4,4) %) izolált mesenterialis artériákban. Az artériás merevséghez hasonlóan az endothelium-függő dilatáció (EDD) jelentősen károsodott a WD egerekben, és az antibiotikum-kezelés megfordította ezt a diszfunkciót (3. ábra, A és B). A nitrogén-oxid szintáz gátlása l-NAME-vel csökkentette az EDD-t minden csoportban, így a maximális acetilkolin által közvetített dilatáció minden csoportban hasonló volt (3. ábraC). Az l -NAME által gátolt dilatáció csökkent volt WD egerekben, és helyreállt antibiotikum-kezeléssel (3. ábraD). Az endothelium-független dilatációt diéta vagy antibiotikum-kezelés nem változtatta meg (3. ábra, E és F).

2. ábra.Az antibiotikumok megfordítják a nyugati étrend által kiváltott artériás merevséget. A: az artériás merevséget sorozatosan mértük az aorta pulzus hullám sebességével (aPWV). Az antibiotikus kezelést a WD egerek egy részében 5 hónapos WD etetés után kezdtük meg, az indikációnak megfelelően. B: a közeg vastagságát a proximális mellkasi aorta szegmensében határoztuk meg. A statisztikai elemzést ismételt ANOVA (aPWV) és egyirányú ANOVA (tápközeg vastagság) alkalmazásával, Tukey post hoc tesztjével végeztük. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki; n = 10–12/csoport. *P

3. ábra.Az antibiotikumok visszafordítják a nyugati étrend által kiváltott endotheliális diszfunkciót és helyreállítják az l -NAME által gátolt dilatációt. Az endothelium-függő dilatáció (EDD) önmagában acetilkolinra (ACh) (A és B) és nitrogén-oxid szintáz inhibitor l -NAME (C) mesenterialis artériákban határoztuk meg. D: az l -NAME által gátolt dilatációt, az NO-függő dilatáció mértékét kiszámítottuk a maximális EDD százalékos csökkenésének hiányában, szemben az l -NAME jelenlétével. E és F: endothelium-függő dilatáció (EID) nátrium-nitroprussziddá (SNP). A statisztikai elemzést ismételt ANOVA (EDD és EID dózisválaszok) és egyirányú ANOVA (összes többi eredmény) alkalmazásával végeztük. Amikor jelentős fő hatást észleltek, Tukey post hoc tesztjét végezték el a specifikus páros különbségek meghatározására. Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki; n = 8–12/csoport. *P

A testtömeg, valamint az epididymális és a szubkután zsírtömeg jelentősen megnőtt a WD által, és az antibiotikum-kezelés nem befolyásolta őket (4. ábra, A-C). A plazma leptin és inzulin szintje szintén megemelkedett WD-ben, és nem csökkent jelentősen az antibiotikum-kezeléssel (4. ábra, D és E). Hasonlóképpen, a WD szignifikánsan rontotta a glükóz toleranciát, az antibiotikum-kezelésnek nincs hatása (4. ábraF).

4. ábra.Az antibiotikum-kezelés nem változtatja meg a testösszetételt vagy a glükóz toleranciát. Testsúly (A), epididymális zsírtömeg (B) és a szubkután zsírtömeg (C) WD etetés és antibiotikus kezelés után. Plazma leptin (D) és inzulin (E) multiplex ELISA-val határoztuk meg. F: a görbe alatti terület (AUC) az ip glükóz tolerancia teszthez (GTT). A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, Tukey post hoc tesztjével végeztük. Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki; n = 10–12/csoport. *P

Annak a lehetséges mechanizmusnak a feltárása érdekében, amellyel a bél dysbiosis szuppressziója megfordította az érrendszeri diszfunkciót, megvizsgáltuk az LPS-kötő fehérje (LBP) és az oldható klaszter-differenciálódás-14 (sCD14) plazmaszintjét, a kardiovaszkuláris kimenetelekhez társuló két LPS-jelzőt (35). ). LBP (5. ábraA) és az LBP: sCD-14 arány (5. ábraB) növekedtek WD-ben, és szignifikánsan csökkentek WD + Abx-ben. Ezen adatok fényében legközelebb több proinflammatorikus mediátor plazmaszintjét mértük, amelyet LPS indukált. Az IL-6 és a PAI-1 szignifikánsan növekedett WD-ben, de nem WD + Abx; míg az MCP-1 szignifikánsan csökkent a WD + Abx-ben (5. ábra, C-E). A vaszkuláris diszfunkcióhoz hozzájáruló potenciális mechanizmusok további vizsgálatához megvizsgáltuk a fehérje expresszióját az aortában és a környező PVAT-ban. Az NF-κB foszforilációja, amely szintén az LPS szignalizáció után történik, jelentősen megnőtt a WD egerek aortájában, és az antibiotikum-kezelést követően normalizálódott (6. ábraA). A p67phox, a NADPH-oxidáz (NOX) 2 szabályozó alegységének PVAT-expressziója nőtt WD-ben, de nem WD + Abx, összehasonlítva a kontrolltáplált egerekkel (6. ábraB). Ezzel szemben a PVAT NOX4 expressziója nem volt különbözõ a csoportok között (6. ábraC). Végül a PVAT AGE általában magasabb volt WD-ben (P = 0,053 vs. SD), és szignifikánsan csökkentek a WD + Abx-ben a WD-vel összehasonlítva (6. ábraD).

5. ábra.Az antibiotikum-kezelés gyengíti a nyugati étrend által kiváltott emelkedést az endotoxémia és a gyulladás keringő markereiben. Forgó LBP (A), LBP/sCD14 (B), IL-6 (C), PAI-1 (D) és az MCP-1 (E) plazmában határoztuk meg ELISA-val. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, Tukey post hoc tesztjével végeztük. Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki; n = 5–12/csoport. *P

6. ábra.Az antibiotikum-kezelés gyengíti a nyugati étrend által kiváltott fehérje-növekedést a gyulladás és az oxidatív stressz miatt. A: a foszforilezett és az összes NF-κB arányát az aortában határoztuk meg Western-blot segítségével. A NADPH-oxidáz (NOX) 2 p67phox alegység bősége (B), NOX4 (C), valamint a fejlett glikációs végtermékek (AGE) (D) perivaszkuláris zsírszövetben (PVAT) határoztuk meg Western-blot segítségével. GAPDH expressziót alkalmaztunk a fehérjetöltési különbségek elszámolásához. Reprezentatív blotokat mutatunk be az egyes grafikonok alatt. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, Tukey post hoc tesztjével végeztük. Az adatokat átlag ± SE-ként fejezzük ki; n = 7–12/csoport. *P

Végül számos korrelációs elemzést futtattunk, hogy betekintést nyerjünk a baktériumfajok változásai, a gyulladás és az érrendszer működésének összefüggéseibe. Számos baktériumfaj kapcsolódott az elsődleges eredményekhez; különösen három törzs Bifidobaktériumok fordítottan korreláltak a testtömeggel, az LBP-vel és az érrendszeri funkcióval (lásd 1. kiegészítő ábraA, elérhető a cikk online változatával és az 1. táblázattal). Ezenkívül az LBP szignifikánsan korrelált az érfunkció mindkét indexével, az l -NAME által gátolt dilatációval, valamint a szisztémás és érrendszeri gyulladással (1. kiegészítő ábra, B-E). Ezek az eredmények együttesen olyan eseménysorozatot támogatnak, amelyben a WD által kiváltott redukció Bifidobaktériumok fokozza az LPS transzlokációját és a szisztémás szignalizációt, ami viszont gyulladásos választ terjeszt, amely az érrendszeri diszfunkciókat vezérli.

1. táblázat: Összefüggések a baktériumok mennyisége és a fiziológiai eredmények között standard és nyugati táplálékkal táplált egerekben

A korrelációkhoz a standard étrend (SD) és a nyugati étrend (WD) csoportok vegyes adatait használtuk. B., Bifidobacterium; EDD, endothelium-függő dilatáció; aPWV, az aorta impulzus-hullám sebessége; LBP, LPS-kötő fehérje; BW, testtömeg. n = 9–12/csoport.

* P l -NAME által gátolt dilatáció. Végül az étrend okozta érrendszeri diszfunkció korrelált számos baktérium taxon, nevezetesen számos Bifidobacterium. Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a béldiszbiózis ok-okozati tényező lehet az érrendszeri diszfunkció kialakulásában, és arra utalnak, hogy a bakteriális eredetű LPS potenciálisan szerepet játszik ezeknek az eseményeknek a közvetítésében. Ezek az eredmények kiterjesztik a bél dysbiosisát más kardiovaszkuláris rendellenességek, köztük az érelmeszesedés és a magas vérnyomás kialakulásával kapcsolatos legújabb adatokat (60), és további támogatást nyújtanak annak a gondolatnak, hogy a bél mikrobiota a jövőben terápiás célpontot jelent a szív- és érrendszeri betegségek számára (30).

A nyugati étrend által kiváltott elhízás rágcsálómodelljei hasonló mikrobiális összetételű változásokat mutatnak mikrobiális összetételüknél, mint az elhízottak esetében, beleértve a megnövekedett Firmicutes: Bacteroidetes arányt (40, 62), és ezeket a változásokat metabolikus zavarok kísérik (8) . A bél mikrobiota antibiotikumokkal történő elnyomását számos állatmodellben alkalmazták a bél mikrobiota ok-okozati szerepének megállapítására a betegség kockázatában vagy a progresszióban (11, 37, 52, 61). Például antibiotikumokat használtak a bél mikrobiota kötelező szerepének megállapítására a proimetogén trimetilamin vegyület előállításában N-oxid (TMAO) (65).

Tudomásul vesszük, hogy egy további kontrollcsoport hiánya, amely normál étrenddel (SD) táplálkozik és antibiotikumot kap, a jelen tanulmány jelentős korlátja. Korábbi kutatások nem figyelték meg az alacsony zsírtartalmú étrendtel táplált egerekben az antibiotikum-kezelés hatását az endotoxémia markereire vagy az anyagcsere-paraméterekre (8, 11). Tekintettel arra, hogy az SD-vel táplált egerek normális vaszkuláris funkciót mutatnak, nem számítottunk arra, hogy az SD + Abx csoport felvétele bármilyen jelentős betekintést nyújt a bél dysbiosis szerepébe az érrendszeri diszfunkció közvetítésében. Megfigyeltük azonban az aPWV enyhe, életkorral összefüggő növekedését SD csoportunkban. Tehát, ha ez a növekedés a mikrobiális összetétel változásához kapcsolódott, akkor az antibiotikum-kezelés gyengíthette ezt a növekedést. E korlátozástól függetlenül eredményeink azt mutatják, hogy a nyugati étrend által kiváltott dysbiosis fontos tényező az érrendszeri diszfunkció kialakulásában.

Összefoglalva, a jelen munka megerősíti azokat a korábbi kutatásokat, amelyek a bél dysbiosisát összekapcsolják az endotheliális diszfunkcióval, és elsőként bizonyítja, hogy a bél dysbiosisának elnyomása megfordítja a nyugati étrend által kiváltott artériás merevséget. Az adatok mechanisztikus betekintést nyújtanak a diszfunkció downstream mediátoraiba, és további támogatást nyújtanak a mikrobiotára célzott terápiák kifejlesztéséhez a szív- és érrendszeri betegségek kezelésében és megelőzésében.

Ezt a tanulmányt a Boettcher Alapítvány Webb-Waring orvosbiológiai kutatási programja (C. L. Gentile) támogatta.

A szerzők nem jelentenek be pénzügyi vagy egyéb összeférhetetlenséget.