A Cangju Qinggan Jiangzhi főzet csökkenti az alkoholmentes steatohepatitis kialakulását és a Kupffer-sejtek aktiválódását

Yang Cheng és Jianjie Chen

qinggan

Pudong új körzetének fertőző betegségei kórháza

# 46, 3018-as sáv, Kelet-Huaxia út, Sanghaj 201299, (PR Kína)

E-mail [email protected]; [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

A máj-rezidens makrofágok, a Kupffer-sejtek a mielomonocita populációból származnak, a máj szinuszoidjaiban kolonizálódnak, és a máj nem parenhimális sejtjeinek 20% -át teszik ki [14]. Az összesített vizsgálatok kimutatták, hogy a Kupffer-sejtek a legfontosabb immunsejtek a NAFLD patogenezisében, valamint az elhízás és az inzulinrezisztencia gyulladásos mediátorainak magsejtjei is [15-17]. A Kupffer-sejtek az első védekező gát a májban, és fontos szerepet játszanak a máj veleszületett immunitásában a Toll-szerű receptor (TLR) szignálozás útján [18]. Az aktivált Kupffer-sejtek különféle utakon vehetnek részt a NAFLD patogenezisében [19-22]. Először is, az aktivált Kupffer-sejtek kölcsönhatásba lépnek más májsejtekkel, beleértve a hepatocitákat is, és különféle bioaktív anyagokat, például citokineket, kemoattraktánsokat, proteolitikus enzimeket és reaktív oxigénfajtákat (ROS) szabadítanak fel biokémiai támadások kiváltására [5, 23]. Másodszor, az aktivált Kupffer-sejtek másodlagos gyulladásos reakcióhoz vezethetnek azáltal, hogy szekretálják a kemokineket és expresszálják az adhéziós receptorokat a neutrofilek, a T-limfociták, az NK-sejtek és a vér monocita-eredetű makrofágok toborzásához a májba [5, 23]. Így a Kupffer-sejtek aktiválásának célzása kulcsfontosságú megközelítés lehet a NASH progressziójának elnyomásában [19].

A kórházunkban megfogalmazott Cangju Qinggan Jiangzhi főzet (CQJD), a hagyományos kínai orvoslás (TCM) receptje az Atractylodes chinensis (6 g), a sült atractylodes (10 g), a lótuszlevél (10 g), a kaszia (10 g), krizantém (10 g) és Typha angustifolia (6 g). A CQJD-t kórházunkban a NAFLD kezelésére használták, és jó eredményt hozott. A CQJD hatékonyan javíthatja a beteg tüneteit és a laboratóriumi biokémiai mutatókat. Ezenkívül korábbi kísérleteink azt mutatták, hogy a CQJD hatékonyan javíthatja a máj steatosisát és a gyulladásos májkárosodás mértékét egy CCl4 által kiváltott májfibrózisos egérmodellben (kínai nyelvű cikk). Arról azonban keveset tudni, hogy a CQJD termel-e védőhatást a NASH ellen, és a kapcsolódó alapmechanizmusokat még ki kell deríteni.

Ebben a tanulmányban a CQJD potenciális terápiás szerepét kerestük a Kupffer-sejt aktiváció és a NASH patogenezis szabályozásában. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) és az elhízás krónikus állapothoz vezet, alacsony fokú gyulladáshoz, fokozott ROS-termeléshez és sejthalálhoz. Ezért először azt teszteltük, hogy a CQJD szerepet játszik-e a HFD által kiváltott májkárosodás patogenezisében. Ennek felhasználásával in vivo A CQJD dózisfüggő protektív hatását figyeltük meg a máj károsodásában, a lipidek felhalmozódásában, a gyulladásban és a mitokondriális oxidatív stresszben. Ezen túlmenően, tanulmányunk transzlációs potenciáljának további fokozása érdekében meghatároztuk a CQJD szerepét egy metionin- és kolinhiányos (MCD) diéta által kiváltott NASH egérmodellben is [24].

Anyagok és metódusok

NASH egér modell

A magas zsírtartalmú étrend által kiváltott NASH egérmodellről korábban beszámoltak [25]. Röviden: a hím C57BL/6J egereket (20-25 g testtömeg) 8-12 hetes korban vásároltuk meg a Shanghai Laboratory Animals Center-től. Az állatoknak beadott összes műtéti és gondozási eljárás összhangban volt a Sanghaji Laboratóriumi Állatok Központjának intézményi útmutatójával. Az összes egeret 21 ± 1 ° C hőmérsékleten, 55 ± 10% páratartalom mellett 12 órás fény/12 óra sötét ciklusban helyeztük el, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Miután az egerek alkalmazkodtak a környezethez, a normál kontrollcsoport C57BL/6J egereit standard chow-étrenddel etették, míg a többieket HFD-vel (kb. 1,67 kcal/g), amely 79,5% kukoricaporból állt, 0,5% koleszterin és 20% zsír. A metionin- és kolinhiányos étrend (MCD) egérmodell előállításához 8 hetes hím C57BL/6J egerek csoportjait (n = 8) helyeztük az MCD diétára, míg a kontrollokat ugyanazzal a diétával etetjük metioninnal kiegészítve és kolin.

A CQJD elkészítése

Ételbevitel és testtömeg

A táplálékfelvételt és az egér testsúlyát naponta regisztráltuk. A CQJD táplálékfelvételre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához az egereket HFD-n (11 hét) tartottuk, és további 8 napig 10 mg/kg CQJD-vel (alacsony), 50 mg/kg CQJD-vel (magas) vagy vivőanyaggal kezeltük.

Kupffer-sejtek izolálása

A Kupffer-sejteket egérmáj kétlépéses kollagén-szepronáz-perfúzióval, majd 15% Nycodenz (Sigma, D2158, Shanghai, Kína) kétrétegű, szakaszos sűrűség-gradiens centrifugálással izoláltuk. A tenyészetek tisztaságát áramlási citometriás analízissel és mágneses antitest sejtek szortírozásával (anti-F4/80 antitest) értékeltük. Az izolált Kupffer-sejteket 24 órán át tenyésztettük Dulbecco módosított sas-táptalajában (DMEM), amely 10% magzati szarvasmarha-szérumot és 1% antibiotikumot (100 U/ml penicillin és 100 μg/ml streptomicin) tartalmazott, nedvesített inkubátorban, 37 ° C-on, 5% -os tenyésztéssel. CO2. A Kupffer-sejtek aktiválásához lipopoliszacharidot (LPS) (1 ng/ml; Sigma; L2880) és/vagy palmitinsavat (400 μM; Sigma; P5585) adunk a táptalajhoz, és a sejteket tovább stimuláljuk 12 órán át. A sejteket az LPS vagy a palmitinsav beadása előtt 2 órán át CQJD-vel kezeltük.

Kvantitatív valós idejű PCR

Hematoxilin és eozin festés

A májszövetet 10% -os formalinban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A friss májszövetet optimális vágási hőmérsékletű (OCT) vegyületben szárazjégen lefagyasztották, és 5 μm-es metszetekre kriozektálták. A májmintákat fénymikroszkóppal értékeltük.

A máj trigliceridek mérése

A betakarított májszöveteket kloroform/metanol (2: 1 v/v) elegyben homogenizáltuk Polytron szövetdaráló alkalmazásával, és lipidkivonatokat készítettünk a klasszikus Folch-módszerrel, amint arról korábban beszámoltunk [10]. Az extraktumokat szárítottuk és izopropanolban oldottuk. A máj triglicerid szintjét biokémiai úton mértük a triglicerid reagens készlettel (Jiancheng Bioeng. Com., Nanjing, Kína).

A szérum ALT és AST mérése

A kapott vérmintákat 1 órán át szobahőmérsékleten tartottuk. Ezután a szérumot 15 percig 840xg-vel végzett centrifugálás után összegyűjtöttük. A plazma alanin-amino-transzferáz (ALT) és az aszpartát-amino-transzamináz (AST) aktivitását az Rsbio (Shanghai, Kína) kereskedelmi készletével mértük a gyártó utasításainak megfelelően.

Caspase-3/7 aktivitás detektálása

A Caspase-3/7 aktivitásokat az Apo-ONE homogén Caspase-3/7 vizsgálati készlet (Promega, Madison, WI) segítségével is mértük a gyártó utasításainak megfelelően.

MPO aktivitás mérése

Az MPO aktivitását a hipoklorinsav és a taurin reakciója alapján határozták meg taurin-klór-amin előállítására, majd ezt az oxidálószert későbbi mérésekkel a 3, 3 ', 5, 5'-tetrametil-benzidin reagenssel a gyártó utasításainak megfelelően (Sigma-Aldrich, Shanghai, Kína).

Az M1dG mérése

Röviden, a DNS-t standard technikákkal izoláltuk. A DNS mennyiségét és minőségét Nanodrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, USA) mértük. A 32P-utáni jelölési technikát alkalmaztuk a 3- (2-dezoxi-β-d-eritropentofuranozil) -pirimido [1,2-a] purin-10 (3H) -on (M1dG) szintjének mérésére. Az M1dG adduktok és az összes nukleotid kimutatását és mennyiségi meghatározását foszfor képalkotó rendszerrel (Typhoon 9210, Amersham) és ImageQuant szoftverrel (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) végeztük.

A 4-HNE és a 3-NT mérése

A máj 4-HNE szintjét kereskedelmi forgalomban lévő készlet segítségével (Cell Biolabs, USA) mértük. Röviden: a BSA-t vagy a májszövet homogenizátumait (10 μg/ml) felszívtuk 96 lyukú lemezekre. A szövetmintákban található HNE-t anti-4-HNE antitesttel, majd HRP-konjugált szekunder antitesttel rögzítettük. A mintákban a 4-HNE szintjét a BSA-HNE-vel előállított standard görbe alapján határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően. A máj 3-NT szintjének kimutatásához kereskedelmi forgalomban lévő ELISA készletet használtak fel Abcam-től (ab116691, Shanghai, Kína).

A TNFα, IL1β és CCL2 ELISA elemzése

ELISA teszttel a sejttenyészet felülúszóiból TNFα, IL1β és CCL2 szinteket mértünk egér immunvizsgálatokkal (R&D Systems, Minneapolis, MN), a gyártó utasításainak megfelelően.

Statisztikai analízis

A CQJD komponensei között számos kivonat bizonyítottan védő szerepet játszik a májkárosodás ellen. Az Atractylodes chinensis fő kivonatai, az Atractylone és a β-eukalyptol, hatékonyan csökkenthetik a szérum ALT, AST szintjét a CCl4 által kiváltott akut májkárosodás egér modellben. A krizantém kivonat gátolhatja a máj lipidfelhalmozódását a NAFLD egerekben, és a mechanizmus összefüggésben lehet a máj antioxidációs hatásának fokozásával. És mtsai. megállapította, hogy a lótusz levél flavonoidjai gátolhatják a NAFLD patogenezisét egerekben a máj triglicerid szintjének csökkentésével [39]. Luo és mtsai. számoltak be arról, hogy a cassia kivonat egyik alkotóeleme, az antrakinon, megakadályozhatja az alkoholos zsírmáj betegségeket a zsíranyagcsere, az anti-lipid oxidáció, valamint a PPAR-γ mRNS és a fehérje expressziójának fokozásával [40]. Ebben a tanulmányban a mi in vivo és in vitro kísérletek azt mutatták, hogy a CQJD hatékonyan képes csökkenteni a HFD és az MCD diéta által kiváltott NASH patogenezist, amint azt a csökkent májszöveti károsodás és a steatosis, a csökkent máj lipid lerakódása és a máj biokémiai funkciójának jelentős javulása bizonyítja. A CQJD egyes komponenseinek részletes szerepét megalapozó pontos mechanizmus azonban további vizsgálatokat indokol.

Összefoglalva, a jelenlegi adatok megerősítik a CQJD terápiás szerepét a HFD- és MCD-étrend által kiváltott NASH-ban a steatosis enyhítésével, a gyulladásos citokintermelés csökkentésével és a Kupffer-sejtek aktiválásával. Adataink azt mutatják, hogy a CQJD ígéretes új utat jelenthet a NASH kezelésében. A CQJD mechanizmusának fontossága a Kupffer-sejtek aktiválásában a NASH-ban azonban további tanulmányokat igényel, mivel ezek az információk pontosabb terápiás utat nyújthatnak ennek a gyakori májbetegségnek.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Sanghaji Pudong Egészségügyi Iroda kiemelkedő vezetői képzési programja (PWRL2016-01 támogatásszám) és a „TCM hepatológia” kulcsfontosságú tudományág építési projektjei (PWZxk2017-30) finanszírozták.

Közzétételi nyilatkozat

A szerzők megerősítik, hogy nincsenek összeférhetetlenségek.