A Casitas B-Lineage limfóma RING domén inhibitorok védik az egereket a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízás és inzulinrezisztencia ellen

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Min Wu, Lin Sun

Csengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Min Wu, Lin Sun

Nyugat-kínai kórház, Szecsuani Egyetem, Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

A Patológiai és Laboratóriumi Orvostudományi Osztály, Kansas Medical Center Egyetem, Kansas City, KS, Amerikai Egyesült Államok

Csengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Chengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Csengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Chengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Csengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Chengdu Orvosi Főiskola Gyógyszerészeti tagozat. Csengdu, Szecsuán tartomány, Kína

Min Wu,
Lin Sun,
Ziyan Yuan Pessetto,
Zhihe Zang,
Xingliang Xie,
Ling Zhong,
Qing Su,
Wang Zan,
Xiurong Gao,
Yan Zhao

Ábrák

Absztrakt

A casitas b-lineáris limfóma (c-Cbl) egy fontos adaptív fehérje, amelynek belső E3 ubiquitin ligáz aktivitása van, és kölcsönhatásba lép az E2 fehérjékkel, például az UbCH7-gyel. A c-Cbl létfontosságú szerepet játszik a receptor tirozin-kináz jelátvitel szabályozásában. A c-Cbl részt vesz az egész test energia homeosztázisában, ami potenciális célponttá teszi a 2-es típusú cukorbetegség és az elhízás kezelésében. Jelen tanulmányunkban két szülői peptidet és 55 módosított peptidet terveztünk az UbCH7 L1 és L2 hurok struktúrája alapján. A módosított peptidek közül tizenhárom fokozott gátló aktivitást mutatott fluoreszcencia polarizáción alapuló vizsgálatban. A vizsgálat in vivo bizonyítási elvében a 10., 34., 49. és 51. peptiddel kezelt egereket megvédték a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízástól és inzulinrezisztensek voltak. Ezek az inhibitorok potenciálisan új terápiás alternatívákhoz vezethetnek az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség esetén.

Idézet: Wu M, Sun L, Pessetto ZY, Zang Z, Xie X, Zhong L és mtsai. (2015) Casitas B-Lineage Lymphoma RING domén inhibitorok védik az egereket a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízás és inzulinrezisztencia ellen. PLoS ONE 10 (8): e0135916. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135916

Szerkesztő: Eugene A. Permyakov, Orosz Tudományos Akadémia, Biológiai Instrumentációs Intézet, OROSZ FÖDERÁCIÓ

Fogadott: 2014. október 17 .; Elfogadott: 2015. július 28 .; Közzétett: 2015. augusztus 21

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a projektet a Nemzeti Tudományos Alapítvány a Kínai Kiemelt Fiatal Tudósok számára (támogatás száma: 81102326), a Csengdu Orvosi Főiskola a fő gyógyszerészeti kutatás-fejlesztési program számára (támogatás száma: CYXK2012006) és a tartományi egyetemek innovatív kutatócsoportjának támogatása Szecsuán tartományban ( 13TD0028). A szerzők köszönetet mondanak a Sun labor tagjainak a hasznos beszélgetésekért. Ezt a munkát az NCATS CTSA-támogatása is támogatta, amelyet a Kansasi Egyetem Határügyi Orvosi Központja kapott: a Heartland Institute for Clinical and Translational Research # KL2TR000119. A tartalom kizárólag a szerzők felelőssége, és nem feltétlenül képviseli az NIH vagy az NCATS hivatalos nézeteit.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A c-Cbl fehérje RING ujj doménjén belül mutációt expresszáló c-Cbl A/- (C379A) egerekről kiderült, hogy a c-Cbl -/- egerekhez képest nagyon hasonló fenotípusúak. A c-Cbl A/- egerek zsírszövet-, inzulin-, leptin- és trigliceridszintje csökkent a vad típusú egerekhez képest [4]. Javított glükóz toleranciájuk van a vad típusú egerekhez képest is [4]. Megnövekedett oxigénfogyasztás volt megfigyelhető. A kutatók megvizsgálták a mutáns c-Cbl-t expresszáló egereket a PI3K kötő doménnel ablált (c-Cbl F/F) egerekkel. Ezek az egerek (c-Cbl F/F) hasonló inzulinérzékenységet, testösszetételt és energiafelhasználást mutattak, mint a kontroll vad típusú egerek [2–4]. Ezért ezek az adatok arra utalnak, hogy a c-Cbl ubiquitin ligáz aktivitás fontos szerepet játszik az egész test energia-anyagcseréjének szabályozásában [4]. Mindezek az adatok hangsúlyozzák, hogy a c-Cbl ígéretes terápiás célpont az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség szempontjából. Itt javasoljuk olyan c-Cbl RING domén inhibitorok előállítását, amelyek peptidomimetikus megközelítéssel funkcionálisan utánozhatják a c-Cbl RING domén mutációt, és kiiktathatják a c-Cbl ubiquitációs funkciót. Feltételezzük, hogy a c-Cbl inhibitorok megvédik az egereket a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízástól és inzulinrezisztenciától.

Az ubiquitációhoz három enzim szekvenciális hatása szükséges: (i) egy aktiváló enzim (E1) nagy energiájú tioészter kötést képez a G76 ubiquitin karboxilcsoportjával, ezáltal aktiválva az ubiquitin C-terminálisát; (ii) konjugáló enzim (E2), amely aktív cisztein-maradékokkal rendelkezik, toborozódik és átmenetileg hordozza az aktivált ubiquitint; (iii) egy ligáz (E3) az aktivált ubikvitint az E2-ből a szubsztrát lizinmaradékba továbbítja [7]. Itt javasoljuk az E2 – E3 kötőfelület inhibitorainak megtervezését. Az E2 – E3 (fehérje-fehérje) interfészek laposak és kiterjedtek; nincs jól körülhatárolható zseb, például enzimaktív helyekkel. Ezért ez a topológia megkönnyíti több jelző partner számára, hogy ugyanahhoz a helyhez kötődjenek [8]. A természetes vagy bioaktív anyagokból származó molekulák jó jelöltek a szűrésre. A peptidek és a fehérjék közötti hidrogénkötés, hidrofób vagy elektrosztatikus kölcsönhatások fokozásával ezeknek a peptideknek a potenciája jelentősen növekedhet. [9].

A vizes oldékonyság, a lipofilicitás, a kémiai stabilitás és az anyagcsere-stabilitás (proteolitikus és enzimatikus lebomlás) gyakran meghatározzák a peptid inhibitorok biológiai hozzáférhetőségét és biodisztribúcióját. A belső fizikai-kémiai tulajdonságok miatt a természetes aminosavakból álló peptidek nem túl jó jelöltek. Ezekről a peptidekről ismert, hogy alacsony a stabilitás a plazmában. Érzékenyek a proteázokra is, és néhány perc alatt eltávolíthatók a keringésből [10]. A peptid inhibitorok aktivitásának és stabilitásának javítására irányuló stratégiák magukban foglalják a peptid korlátozását a kötött megerősítésig, a peptid ciklizálását, a peptidkötések bioszterikus helyettesítését, az aminosavak sztereokémiájának megváltoztatását (D konformáció) és a peptid végének lezárását [11–17] . Ezért az Fmoc-védett aminosav-analógok alkalmazását javasoltuk az egyes maradékok szerepének vizsgálatára és az aktivitás növelésére.

Anyagok és metódusok

Peptidek és fehérjék

A peptideket és peptid-utánzó szereket a MitenChem (Kína) cégtől vásárolták, tisztaságuk ≥ 98% volt. A rekonstruált peptidek koncentrációértékeit aminosav-analízissel határoztuk meg a fehérjemag-létesítményben (Chengdu Medical College). A rekombináns Cbl fehérjét a Chengdu Medical College Protein Core Facility gyártotta, és korábban leírták [9]. A c-Cbl (RING) fehérjét, beleértve a linkert és a RING domént (358–457 kodon), Glutation S-Transferase-zel (GST) jelöljük és GSH-Sepharose-val (Shanghai Biopharma) tisztítjuk [9].

Fluoreszcencia polarizációs (FP) vizsgálat

Az FP vizsgálatot korábban kidolgozták és validálták [9]. Röviden, a fluoreszceinnel jelölt próbát (FITC-βA-PFKPP-NH2, 100 nmol/l) és a Cbl (RING) fehérjét (3 μmol/l) összekevertük, és a végső koncentrációra hígítottuk 0,01% Triton X-100 PBS-ben ( pH = 7,4). Ezután 19 μl-t ebből a mesterkeverékből minden reakcióedénybe betöltöttünk. A peptideket vagy peptid-utánzó szereket ezután a kijelölt üregekbe töltöttük (1 μl, 10 μmol/L - 0,078 μmol/L, félszeres hígítások). Az összes fluoreszcencia és polarizáció értékét 485 nm gerjesztési hullámhosszon és 538 nm emissziós hullámhosszon mértük ZS-2 lemezolvasóval. Az adatokat illesztettük, és a SigmaPlot 11.0 alkalmazásával megbecsültük az ΔmP, Kd és Ki értékeket.

In vivo vizsgálatok [2–4, 18].

Valamennyi kísérletet az intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottság (Chengdu Medical College, Kína) hagyta jóvá. Valamennyi kísérletet 10 hetes hím egerekkel végeztük, amelyeket a C57BL/6 háttérrel tartottunk fenn. Az összes állatot 12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez.