A folsavfelesleg növeli a zsírtartalmú étrendet tápláló patkányok zsírtartalmát, súlygyarapodását és zsírszövet-gyulladását

Karen B. Kelly

John P. Kennelly

Marta Ordonez

2 Baszkföldi Egyetem Természettudományi és Technológiai Kar Biokémiai és Molekuláris Biológiai Tanszék (UPV/EHU), Bilbao 48080, Spanyolország; [email protected] (M.O.); [email protected] (A.G.-M.)

Randal Nelson

Kelly Leonard

Sally Stabler

3 Orvosi Osztály, Colorado Egyetem Orvostudományi Kar, Aurora, CO 80206, USA; [email protected]

Antonio Gomez-Muñoz

Catherine J. Field

René L. Jacobs

4 Biokémiai Tanszék, Alberta Egyetem, Edmonton, AB T6G2R7, Kanada

Absztrakt

A folsavbevitel sok országban magas szintre emelkedett, ami aggályokat vet fel a lehetséges káros hatásokkal kapcsolatban, ideértve az energia- és a lipidanyagcsere zavarait is. Célunk az volt, hogy rágcsálómodellben megvizsgáljuk a folsavfelesleg (EFA) és a megfelelő folsav (AFA) bevitelének az anyagcsere-egészségre gyakorolt hatását. Ezeket a vizsgálatokat 15% energiatartalmú alacsony zsírtartalmú étrend vagy 60% magas zsírtartalmú étrend mellett végeztük. Az EFA-val táplált patkányokban nem volt különbség a súlygyarapodásban, a zsírtömegben vagy a glükóz toleranciában az AFA-val táplált patkányokhoz képest, amikor LF étrendet etettek. Azonban az EFA-t HF-étrenddel kombinálva táplált patkányoknál szignifikánsan nagyobb volt a súlygyarapodás és a zsírtömeg, mint az AFA-val táplált patkányokban (p Kulcsszavak: folsav, elhízás, metabolikus szindróma, zsírszövet

1. Bemutatkozás

A metabolikus szindróma, amely magában foglalja a hasi zsírfelesleget, az inzulinrezisztenciát, a dyslipidaemiát és a magas vérnyomást, jelenti a fejlett országok legnagyobb közegészségügyi kihívását [1]. A metabolikus szindróma prevalenciájának növekedését az elmúlt évtizedekben az étrendi szokások változása tükrözi, tükrözve a tápanyagok megnövekedett rendelkezésre állását [2]. A zsírban és gyorsan emészthető szénhidrátokban gazdag étrend növelte a teljes energiafogyasztást [2]. Ugyanakkor a vágott élelmiszerek dúsítása és a kiegészítők széles körű használata számos nyugati országban megnövelte a folsavbevitelt, és fontos szerepet kapott a lehetséges káros hatások kivizsgálásában [3].

Az anya felesleges folsav- [17,18] vagy metil-donor [19] bevitele terhesség alatt állatmodellekben súlygyarapodást vagy a metabolikus szindróma összetevőit okozza az utódokban. Ezek a hatások még hangsúlyosabbak lehetnek, ha az utódokat magas zsírtartalmú étrendben táplálják [20,21]. Emberekben a terhesség alatti magas vörösvértest-folát-státusz a hatéves korú gyermekek megnövekedett zsírtömegével járt [22]. Úgy tűnik, hogy a folsav befolyásolja az energia- és lipidanyagcserét a DNS-metiláció és a génexpressziós minták modulálásával [17,18,23]. A diéta-gén kölcsönhatások az egész életen át fontos egészségmeghatározók maradnak [24], és így a felesleges folsav felnőttkorban továbbra is elősegítheti az energia- és a lipid-anyagcsere változásait. A felesleges folsavbevitel hatása a metabolikus szindróma kockázatára és a felnőttkori zsírbetegségre azonban továbbra sem ismert.

Az étkezési folsavfelesleg májra gyakorolt hatását, amely mind a folát, mind a lipid anyagcsere fontos helyszíne, rágcsáló modellekben vizsgálták [23,25]. A folsavfelesleg elősegítheti az egyik szén-anyagcsere út és a génexpressziós minták változását, ami májkárosodáshoz vezethet [25]. Bizonyíték van arra, hogy a metildonorok, beleértve a folsavat is, a génexpresszióra szövet-, hely- és génspecifikusak lehetnek, ezért indokoltak a folsavfelesleg más szövetekre (pl. Zsír) gyakorolt hatásának vizsgálata. [3].

Vizsgálatunk célja a folsavfelesleg (EFA) túlzott bevitelének és a megfelelő folsav (AFA) bevitelnek a patkányok anyagcsere-egészségére gyakorolt hatásainak vizsgálata volt. Feltételeztük, hogy az EFA-t tartalmazó étrend fogyasztása megváltoztatja a lipid- és glükóz-anyagcserét. A magas zsírtartalmú étrendet általában a súlygyarapodás és a metabolikus szindróma összetevőinek tanulmányozására használják állatmodellekben. Ezért vizsgálatainkat az energia alacsony zsírtartalmú (LF) 15% és a magas zsírtartalmú (HF) étrend 60% -a mellett végeztük el. Adataink arra utalnak, hogy az EFA HF diétával kombinálva növeli a súlygyarapodást, a zsírszövet tömegét és a gyulladás markereit az AFA-hoz képest, és hogy ezek a hatások nem jelentkeznek az LF diéta hátterében. In vitro támogató kísérleteket végeztünk, amelyek eredményei azt sugallják, hogy a folsav növelheti a triglicerid felhalmozódását a 3T3-L1 sejtekben azáltal, hogy indukálja a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor γ (PPARγ).

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok és diéták

Asztal 1

A diéták összetétele (kilogrammonként).

Összetevők: LF-AFALF-EFAHF-AFAHF-EFA

Folsav (mg)	0,75	7.5	0,75	7.5
l-cisztein (g)	3	3	4	4
Kukoricakeményítő (g)	263.7	263.7	-	-
Szacharóz (g)	209,7	209,7	106.3	106.3
Maltodextrin (g)	130	130	160	160
Szójaolaj (g)	60	60	30	30
Zsír (g)	-	-	310	310
Cellulóz (g)	50	50	20	20
Pektin (g)	50	50	50	50
Szukcinil-szulfatiazol (g)	10.	10.	10.	10.
Vitaminmentes kazein (g)	195	195	265	265
Ásványi keverék, AIN-93G (g)	35	35	48	48
Tercier-butil-hidrokinon (mg)	12.	12.	3400	3400
Kolin-bitartarát (g)	2.5	2.5	3	3
Niacin (mg)	30	30	63	63
Kalcium-pantotenát (mg)	16.	16.	34	34
Piridoxin HCl (μg)	7	7	15	15
Tiamin-HCl (μg)	6.	6.	13.	13.
Riboflavin (mg)	6.	6.	13.	13.
Biotin (μg)	200	200	400	400
B12-vitamin (μg)	25	25	40	40
dl-alfa-tokoferil-acetát (500 NE/g) (mg)	150	150	315	315
A-vitamin palmitát (500 000 NE/g) (mg)	8.	8.	17.	17.
Kolekalciferol (500 000 NE/g) (mg)	2	2	4	4
Filokinon (μg)	800	800	1600	1600

2.2. A zsír- és májminták szövettani elemzése

A zsírszöveteket összegyűjtöttük, dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk. A szövet keresztmetszeteit (5 μm) készítettük és haematoxilinnel és eozinnal (H és E) festettük. A zsírsejtek méretét ImageJ szoftver segítségével becsültük meg (az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete, Bethesda, MD, USA).

2.3. Glükóz tolerancia tesztek

Nyolc héttel a magas zsírtartalmú étrend (HFD) etetési kísérlet megkezdése után a patkányokat egy éjszakán át éheztettük, mielőtt 2 g/kg glükózt kaptak volna intraperitoneális (IP) injekcióval. A vérmintákat farokvénás vérzéssel vettük 15., 30., 60., 90. és 120. percben.

2.4. Plazma mérések

A plazma glükóz- és alanin-aminotranszferázt (ALT) kereskedelemben kapható készletekkel (WAKO Diagnostics (Mountain View, CA, USA) és Biotron (Diagnostic Inc., Hemet, CA, USA)) mértük. A plazma inzulint ELISA módszerrel mértük (ALPCO, Salem, NH, USA). A metabolitok plazmaszintjét egy szénciklusban, beleértve a folátot, az összes homociszteint, a metionint, a ciszteint, az N, N-dimetilglicint, az N-metilglicint, a glicint, a szerint, a cisztationint, az a-amino-butirátot, kapilláris stabil izotóppal hígított gázkromatográfiával mértük tömegspektrometria, a korábban leírtak szerint [26]. A semleges lipideket a plazmában gáz-folyadék kromatográfiával határoztuk meg az előzőekben leírtak szerint [27], belső standardként tridekanoint alkalmaztunk.

2.5. A 3T3L1 adipociták tenyésztése

A 3T3-L1 sejteket összefolyásig tenyésztettük Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM), amelyet 10% (v/v) szarvasmarha-magzati szérummal (FBS) egészítettünk ki. Az összefolyás után két nappal (a 0. napot jelöltük) a sejteket 10% (v/v) FBS-sel, 1 μM dexametazonnal, 0,5 mM izobutil-metilxantinnal, 1 μg/ml inzulinnal kiegészített DMEM-sel differenciálásra indukáltuk. A sejteket 9 uM (standard szint) vagy 20 uM (kiegészített) folsavval inkubáltuk. A differenciáló közegeket naponta frissítettük. 48 óra elteltével a táptalajt 10% FBS-sel és 1 μg/ml inzulinnal kiegészített DMEM-mel helyettesítettük, és ugyanolyan folsavval, amelyet a differenciálás során használtunk. A sejtközeget 24 óránként frissítettük a differenciálást követően.

2.6. Analitikai eljárások

A citokinek és kemokinek szöveti szintjét ELISA készletek alkalmazásával számszerűsítettük a gyártó utasításai szerint (Preprotech, Rocky Hill, NJ, USA vagy eBioscience, San Diego, Kalifornia, USA). A trigliceridek 3T3L1 adipocitákban történő méréséhez a sejteket háromszor öblítettük steril PBS-ben, majd kaparással 2 ml PBS-ben gyűjtöttük össze. A sejteket örvényléssel megszakítottuk, majd 3 × 15 s ultrahanggal kezeltük. A triglicerideket kolorimetriás vizsgálattal mértük a gyártó utasításainak megfelelően (Sekisui Diagnostics, Lexington, MA, USA).

2.7. mRNS mennyiségi meghatározása

Az mRNS-t a korábban leírtak szerint számszerűsítettük [28]. Röviden, a teljes RNS-t izoláltuk a szövetekből Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával. Ezután az RNS-t reverz átírással használtuk a Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával. Az univerzális probe könyvtárat (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) minden egyes vizsgált génhez primerek és megfelelő próbák tervezéséhez használtuk. A kvantitatív PCR-t három példányban futtattuk a Biomark rendszeren (Fluidigm, South San Francisco, CA, USA) 40 cikluson keresztül. Az egyes gének relatív mRNS-expresszióját a ciklofilinnel normalizált ΔΔCT módszerrel számítottuk.