A gazdafajta és az étrend különbségei befolyásolják a gyarmatosítást Campylobacter jejuni és helyi immunválasz kiváltása csirkében

Absztrakt

Háttér

A csirkéket tekintik az emberi campylobacteriosis fő tárolójának. Kevéssé ismert a kölcsönhatásról Campylobacter jejuni (C. jejuni) és csirkék. Ezt a kölcsönhatást befolyásolhatja az immunrendszer érési szakasza, a bél mikrobiota összetételének kialakulása és egyéb tényezők, beleértve a fajtát és az étrendet. Célunk a fajta és az étrend hatásának vizsgálata volt C. jejuni kolonizáció és gazdaszervezet immunválaszai csirkéknél. A madarakat 104 4 kolóniaképző egységgel (CFU) oltottuk be C. jejuni vagy hígítószer a kikelés után egy (1. exp.) vagy 22. (2. exp.) napon. Összehasonlítottuk a helyi immunsejtek szubpopulációit, a citokin expressziós szinteket és a bél mikrobiotájának összetételét a brojler típusú (BT) és a réteg típusú (LT) madarak között, amelyeket kereskedelmi brojler takarmánnyal (bf) vagy réteges takarmánnyal (lf) tápláltak.

Eredmények

Alacsonyabb gyarmatosítási arányokat figyeltek meg az idősebb korosztályban, fajtától és étrendtől függetlenül. Fajtától függetlenül a bf-vel táplált madarak CFU-ja magasabb volt C. jejuni az lf táplált csoportokhoz képest. Campylobacter jejuni-az oltás a takarmányozási stratégiától függetlenül szignifikáns hatást gyakorolt a limfocita számra és a citokin expresszió szintjére a BT madarakban (o

Háttér

Campylobacter fajok Campylobacter jejuni (C. jejuni) okozzák az emberi táplálék által közvetített bakteriális gasztroenteritist az ipari világban [1, 2]. Campylobacter jejuni számos háziasított állatban megtalálható, és a csirkék a legfontosabb tározók C. jejuni [3]. Eddig nem valósítottak meg megfelelő stratégiákat, amelyek lehetővé tennék a C. jejuni csirkék gyarmatosítása terepen [4]. A csökkentés C. jejuni a gyarmatosítási arány elérhetõ cél lehet [5, 6]. Míg a pro- és a prebiotikumok következetlen eredményekhez vezettek [7–9], más ellenőrzési intézkedések, beleértve az etetési stratégiákat és a rezisztensebb fajták alkalmazását, jelentősen csökkenthetik a C. jejuni gyarmatosítás [10–12].

Gyakran csak egy idõpontos bejegyzés C. jejuni az oltást nem a gyarmatosítás dinamikáját figyelembe véve vizsgálták [17, 24].

A T-sejtek szerepe a C. jejuni egerekben és emberekben kimutatták, de csirke T-sejt-válaszairól keveset tudni [15, 25, 26]. Azt javasolták C. jejuni a madárfajok fertőzései az immunválasz Th1 polarizációjával társulnak [27, 28].

Spekulálhatunk, hogy a baromfi étrendjének változásai módosíthatják a csecsemőkecse mikrobiotáját és a bélek egészségét, és ezért relevánsan befolyásolhatják a C. jejuni a csirkebélben. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az etetési stratégia megváltoztathatja a béltartalom viszkozitását, valamint a csirkebél hisztomorfológiáját [11], és in vitro módosíthatja a bélrendszer serlegsejtjeinek glikokonjugátjait [29]. Nem teljesen világos, hogy a különböző táplálkozási stratégiák miként változtathatják meg a bélbaktériumok kolonizációs mintázatát, a helyi immunitás kialakulását és ezt követően modulálhatják a helyi immunreakciókat C. jejuni gyarmatosítás. Ezeknek a tanulmányoknak a többségét brojlercsirkékben végezték, és azok közötti kapcsolatra összpontosítottak C. jejuni gyarmatosítás és táplálkozási változások [10, 30–32].

A tanulmány célja a fajta és az etetési stratégia közötti kölcsönhatás vizsgálata volt C. jejuni kolonizáció kereskedelmi hibrid rétegekben és brojler típusú madarakban keresztezéses vizsgálattal. Campylobacter jejuni-Mindkét fajta beoltott és be nem oltott csoportját vagy kereskedelmi célú brojler-takarmánnyal (bf), vagy réteges takarmánnyal (lf) etettük. Vizsgáltuk a lokális és szisztémás immunreakciókat, valamint a bél mikrobiota összetételének lehetséges eltéréseit. Adataink egyértelműen bizonyítják, hogy a takarmány összetétele, valamint a fajtája is befolyásolta a kimenetelt C. jejuni kolonizáció, immunitás kialakulása és a bél mikrobiota, amely alapot szolgáltat a nyomon követési vizsgálatokhoz a C. jejuni gyarmatosítás rezisztensebb fajták szelekciójával, védő etetési stratégiákkal kombinálva.

Mód

Állatok

A kereskedelmi rétegű (LT) hibridek (Lohmann Selected Leghorn, LSL) csirkéiből származó tojásokat a KG Geflügelzuchtbetriebe Gudendorf-Ankum GmbH & Co. KG, Ankum, Németország biztosította, valamint a kereskedelmi forgalomban lévő Ross-308 brojler típusú (BT) tojásokat. ) csirkéket a BWE Hatchery Weser-Ems GmbH & Co. KG-től (Visbek, Rechterfeld, Németország) szereztük be. A tojásokat a baromfi klinikán, a németországi Hannoveri Állatorvostudományi Egyetemen inkubáltuk és keltettük. A csirkéket a Hannoveri Állatorvostudományi Egyetem Baromfi Klinikáján tartották és nevelték.

Az összes BT vagy LT madarat az oltás koráig ugyanabban a helyiségben faforgácson tartották. Ezután az oltott és be nem oltott kísérleti csoportokat különböző izolációs helyiségekbe (egy beoltott és egy be nem oltott kontrollmadarak számára) költöztettük drótpadlós egységekkel. Az összes csoport takarmányt kapott ugyanabból a forrásból (brojler típusú vagy réteg típusú takarmányt BT vagy LT madaraknak tápláltak).

A kereskedelemben kapható brojler- és rétegtakarmányt (1. táblázat), valamint a vizet ad libitum adták. A madarakat standard kezdő diétával etették 14 napos korukig, majd a kísérlet végéig termelői étrendet kaptak. A madarakat véletlenszerűen osztották szét különböző csoportokba az SRS (egyszerű véletlenszerű minta) alapján, és naponta megfigyelték a klinikai tünetek jelenlétét. Valamennyi tesztelt madár negatív volt C. jejuni napján kloákás tamponokkal C. jejuni oltás. Az állatok nem kaptak oltást.

Baktériumtörzsek és C. jejuni oltás előkészítése

A C. jejuni A Lior6 szerocsoport törzsét egy csirkéből izolálták a Hannoveri Állatorvostudományi Egyetem Baromfi Klinikáján, és sovány tejben tárolták -70 ° C-on [26].

A mélytartósított baktériumokat felolvasztották és szénszén-cefoperazon-dexoxi-cholát agarra (CCDA, Oxoid, Basingstoke, Anglia) szélesztették. A lemezeket 48 órán át inkubáltuk mikroaerofil körülmények között (10% CO2, 5% O2, 85% hidrogén) 38 ° C-on. 2 nap után egy C. jejuni a telepet 3 ml Standard-I-Bouillon-ba (Merck, Damstadt, Németország) vittük át, és további 48 órán át inkubáltuk mikroaerofil körülmények között, 38 ° C-on.

A bakteriális szuszpenzió 1 milliliterét steril foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) hígítottuk, hogy megközelítőleg 104 CFU/ml (kolóniaképző egység) legyen az orális oltáshoz. A CFU megerősítéséhez C. jejuni az inokulában a baktérium-szuszpenziót 10-szeres hígítási sorozatban sorozatosan hígítottuk, CCDA-lemezekre terítettük és 48 órán át 38 ° C-on inkubáltuk. Inkubálás után a telepeket megszámoltuk a CFU kiszámításához [17].

Intraepithelialis limfociták izolálása és áramlási citometriás elemzés

Az intraepithelialis limfociták (IEL) egysejtű szuszpenzióit a korábban részletesen leírtak szerint készítettük el [33].

Szövettan

A májból és a középső vakbélból vett mintákat összegyűjtöttük, foszfáttal pufferelt formalinban (4%) rögzítettük 24 órán keresztül, majd szövettani vizsgálathoz tovább dolgoztuk fel standard eljárásokat követve. A 2 µm-es szövetszelvényeket mikroszkópos vizsgálattal vizsgáltuk hisztopatológiai elváltozásokra, mint például a vakbél vagy kriptatályog lamina propriájának ödémájára és a sejtek léggömbözésére, az egereknél és a csirkéknél korábban leírtak szerint. C. jejuni oltás [36, 37].

Immunhisztokémia

A középső vakbél fagyasztott szakaszait a korábban leírtak szerint dolgoztuk fel [33, 38]. A metszeteket a következő egér-csirke-ellenes jelöletlen monoklonális antitestek egyikével festettük: anti-CD4, anti-CD8β és anti-Bu1 (0,05 ug/ml) (Southern Biotech, Biozol, Eching, Németország). A szekunder anti-egér IgG biotinilezett antitesteket és az ABC reagenseket (Vectastain® Elite® ABC Kit, Vector Laboratories Inc., Linaris, Wertheim-Bettingen, Németország) a gyártó utasításainak megfelelően alkalmaztuk. Az enzimhez kapcsolt ABC komplexet 3,3′-diaminobenzidin (DAB) kromagén szubsztráttal és hidrogén-peroxiddal (DAB peroxidase szubsztrát szett, Vector Laboratories Inc.) reagáltatva láthatóvá tettük. A metszeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk. A különböző limfocita populációkat úgy értékeltük, hogy 5 reprezentatív mikroszkopikus mező lamina propriájában 3 kriptánként pozitív festett sejtek számát számoltuk össze, állatonként 200-szoros optikai nagyítással [33].

Valós idejű kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR)

A vakbélmintákból a teljes RNS-t 1000 µl Trifast ® -GOLD reagenssel (PeqLab, Biotechnologie GmbH, Erlangen, Németország) izoláltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az RNS minőségét és koncentrációit a NanoDrop ND-1000 (PeqLab, Biotechnologie GmbH) alkalmazásával határoztuk meg.

Az expresszált IL-6 citokinek és a csirke IL-8 homológ, valamint a házfenntartó 28S gén kimutatására szolgáló specifikus primerek és próbák minden részletét korábban leírták [15, 39]. Valós idejű kvantitatív RT-PCR-t az AgPath-ID egylépéses RT-PCR készlet alkalmazásával hajtottunk végre (Applied Biosystems, Ambion, USA). A specifikus termékek amplifikációját és mennyiségi meghatározását az Mx3005P ™ termikus ciklus rendszer és az Mx3005P ™ Q PCR szoftver (STRATAGENE, Agilent Technologies Company, USA) alkalmazásával hajtottuk végre. A következő ciklusprofilt alkalmaztuk: egy ciklus 50 ° C-on 30 percig és 95 ° C-on 10 percig, és 40 ciklus 95 ° C-on 20 másodpercig és 60 ° C-on 1 percig.

Az eredményeket a házfenntartó 28S génnel normalizáltuk [40], amelynek expressziója a madarak között összehasonlítható volt C. jejuni-oltott és be nem oltottakat, és 40-Ct-ként fejeztük ki mRNS-expresszióban a szövetekben C. jejuni oltott madarak és C. jejuni-ingyenes vezérlések.

DNS-tisztítás és piroszekvenálás

Szekvenciaelemzés

Az Illumina szekvenálás után létrehozott Fasta és qual fájlokat feltöltötték a Qiime szoftverbe [41]. A reverz leolvasásokat 250 bp hosszúságúra rövidítettük, és az előre és a reverz szekvenciákat összekötöttük. A minőségi vágási kritériumokat 19 értékre állítottuk be, és nem volt eltérés a MID szekvenciákban. A következő lépésben a kiméra szekvenciákat slayer algoritmussal jósoltuk meg, és kizártuk a későbbi elemzésből. A kapott szekvenciákat ezután az RDP Seqmatch osztályozta, OTU (operatív taxonómiai egységek) diszkriminációs szintet 97% -ra állítva, majd UniFrac elemzéssel [42]. Az adatok vizualizálásához a fő koordináta-analízist (PCoA) használták.

Kísérleti terv

1. kísérlet (1. exp.)

2. kísérlet (2. exp.)

Exp. Az 1-et 22 napos madarakkal megismételtük. 72 kereskedelmi brojlercsirkét és 72 kereskedelmi réteget két alcsoportra osztottak. Alcsoportonként 18 madarat orálisan oltottak be C. jejuni-szabad táptalaj vagy kb. 104 CFU C. jejuni 22 dph-nál. A legtöbb paramétert az Exp. 1. Ebben a kísérletben nem határoztuk meg a citokin expressziós szintjét és a bél mikrobiota összetételét.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéseket a Statistix 10.0 verzióval (Analytical software, Thallahassee, FL, USA) végeztük. A CFU - számok közötti különbségek statisztikai elemzéséhez C. jejuni különböző C. jejuni-azonos korú oltott alcsoportokat a jelzett dpi-nél, Kruskal – Wallis összes páros összehasonlító tesztet alkalmaztunk. A különbségek az IEL T-sejtek részhalmazaiban és az LPL immunsejt-populációk számában C. jejuni-beoltott és be nem oltott kontrollokat kétmintásan határoztuk meg T teszt vagy Wilcoxon Rank összeg T teszt, ill. A citokin expressziós szint közötti különbség C. jejuni-oltott és C. jejuni-a szabad kontroll csoportokat kétmintásan határoztuk meg T teszt. A statisztikai szignifikanciát az o

Eredmények

Klinikai tünetek és szöveti elváltozások

Az egyik vakbélnyílásán nem figyeltek meg klinikai tüneteket, makroszkópos vagy mikroszkópos elváltozásokat C. jejuni-szabad vezérlés vagy C. jejuni-oltott csoportokat mindkét kísérletben. A testtömeg között nem észleltek szignifikáns különbséget C. jejuni-oltott és nem oltott kontrollmadarak az egyes fajtákon és táplálkozási csoportokon belül a különböző boncolási napokon (az adatokat nem mutatjuk be, o > 0,05). A réteges takarmánnyal (lf) etetett BT és LT madarak testtömege az összes boncolási napon szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az adott fajta brojler-takarmányú (bf) táplált csoportoké, o 2. Táblázat A kolóniaképző egységek átlagos száma C. jejuni brojler- és rétegetípusú madarak vakbéltartalmában, akár brojler-, akár rétegtakarmánnyal etetve

Ezen kívül a Exp. 1, a bf-vel táplált LT madarak magasabb CFU-számot mutattak C. jejuni a BT madarakkal összehasonlítva a legtöbb vizsgált időpontban. Ezt a hatást csak az Exp. 2 1 dpi felbontással, míg a későbbi időpontokban a BT madarak gyarmatosítási aránya magasabb volt, mint az LT madaraké.

A helyi bél limfocita populációk kimutatása

A T- és B-limfociták immunhisztokémiai kimutatása a vakbéllemez laminájában

Ahogy a korábbi vizsgálatok alapján várható volt [17], a lamina propriákban a T- és B-limfocita populációk számát az életkor befolyásolta. A Caecal CD4 +, CD8 + és Bu1 + LPL idővel fokozatosan növekedett a kontrollmadarakban (1., 2. ábra).