A gén expressziója az oligodendrocytákban a remyelinizáció során a koleszterin homeosztázist tárja fel, mint terápiás célt a sclerosis multiplexben

Szerkesztette Lawrence Steinman, a Stanfordi Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, és jóváhagyta 2019. április 9-én (2018. december 14-én kapott felülvizsgálatra)

Jelentőség

Sejt-specifikus és régió-specifikus génexpresszióval azonosíthatók terápiás célpontok különböző neuroanatómiai régiókban a neurodegeneratív betegségek során. A sclerosis multiplex (MS) multifokális, és neuroprotektív kezelésekre van szükség. Itt az MS agy RNS szekvenálása azt javasolta, hogy tanulmányozzák az oligodendrocita vonal sejtjeinek (OLC) transzkripcióját olyan helyen, ahol az MS modellben a remyelinizáció történik. A koleszterin-szintézis útvonalak domináltak a legfelsőbb szabályozott utakként a corpus callosum OLC-jében a cuprizone-modellben végzett remyelinizáció során. Az ösztrogén receptor-β ligandum kezelése tovább fokozta a koleszterinszintézis útjait az OLC-kre gyakorolt közvetlen hatás révén. Mivel a magzati OLC-k a méhen belül magas szintű ösztrogénszintnek vannak kitéve az anyai vérben, feltételezzük, hogy a felnőttek ösztrogénkezelésének remyelinizáló tulajdonságai a sérülés során a koleszterin homeosztázisának megcélzásával összesíthetik a normális fejlődési mielinációt.

Absztrakt

A sclerosis multiplex (MS) a központi idegrendszer autoimmun betegsége, amelyet gyulladás, demyelinizáció és axonális károsodás jellemez, minimális remyelinizációval (1). Az SM jelenlegi immunmoduláló kezelése hatékonyan csökkenti a relapszusokat, de nem javítja a fogyatékosságokat. A központi idegrendszeri sejteket megcélzó neuroprotektív kezelésekre van szükség a fogyatékosság javítása érdekében, talán a remyelinizáció növelésével (2).

Az SM-ben az elégtelen remyelinizáció részben azzal függ össze, hogy az oligodendrocita prekurzor sejtek (OPC-k) nem képesek érett myelinizáló oligodendrocytákká differenciálódni (3, 4). Úgy gondolják, hogy ez egy olyan ellenséges központi idegrendszeri mikrokörnyezetből származik, amely gátolja az OPC differenciálódását, mint például gyulladásos citokinek és kemokinek (5, 6), leucinban gazdag ismétlődések és immunglobin-szerű doméntartalmú 1 fehérje (LINGO1) (7) és kondroitin-szulfát proteoglikánok (CSPG) (8). A remyelinizációs stratégiák valószínűleg megkövetelik a központi idegrendszeri gyulladással összefüggő külső tényezők modulálását, valamint az oligodendrocita érésével és mielinizációjával kapcsolatos belső tényezők megcélzását (2), és egyikük a másik nélkül nem biztos, hogy elegendő (9). Továbbá ennek a megközelítésnek hatékonynak kell lennie a felnőttek központi idegrendszerében axonális károsodások esetén, ha ez eredményes lehet SM-ben szenvedő betegeknél.

Az in vivo remyelinizáció során az oligodendrocytákra jellemző molekuláris mechanizmusok axonkárosodással járó krónikus demyelinizáció modelljét alkalmazva terápiás célpontokat tárhatnak fel a remyelinizáció megkönnyítésére az SM-ben. Az oligodendrociták vizsgálata egysejtű és géntechnológiával módosított dúsítási stratégiákon keresztül, majd nagy áteresztőképességű szekvenálással és bioinformatikai elemzésekkel értékes betekintést engedett abba, hogy az OPC-k hogyan szabályozódnak a fejlődési mielináció során (10, 11), valamint arról, hogy a felnőttekből származó OPC-ket miként aktiválják demielinizáció (10). Ami ismeretlen, az az oligodendrocita transzkriptóm in vivo remyelinizáció során felnőttek fehérállományában, axonális károsodás hátterében. Ez közvetlen betekintést nyújtana a terápiás célpontok azonosításához, hogy megkönnyítsék a remyelinizációt az SM-ben.

Itt RiboTag technológiát alkalmaztunk az oligodendrocyta sejt sejt (OLC) -specifikus génexpressziójának meghatározására in vivo a corpus callosumban a remyelinizáció során krónikus cuprizone modellben, amelyet jelentős axonális károsodás jellemzett. A RiboTag technológia magában foglalja a Cre-LoxP rekombinációt, hogy transzgénikus egereket hozzon létre, amelyek specifikus sejttípusokban expresszálják a HA-jelölt riboszómákat (12 ⇓ – 14). Az Olig1-RiboTag egerek lehetővé teszik az OLC-specifikus transzkriptumok izolálását a megcélzott régiókból a felnőtt egerek agyában. MS-modellekben alkalmazva az ezt követő RNS-szekvenálás és elemzések az OLC-k belső mechanizmusait tárhatják fel a felnőttek központi idegrendszerében a sérülés során végzett in vivo remyelinizáció során. Ezt a RiboTag megközelítést alkalmazták itt az oligodendrocytákra jellemző génexpressziós utak felfedezésére a remyelinizáció során a krónikus cuprizone és kísérleti autoimmun encephalomyelitis (EAE) modellekben.

Eredmények

RNS szekvenálás MS agyrégiókban.

Remyelinizáció krónikus demyelinizáció után a Cuprizone diéta okozta sérülésmodellben.

Az oligodendrocita-specifikus transzlatóma megváltozik a krónikus demyelinizációt követő remyelinizáció során. Az Olig1-RiboTag egereket összehasonlítottuk az oligodendrocyta-specifikus génexpresszióval a corpus callosumban a remyelinizációs fázisban 9 hét múlva cuprizonnal táplált egerekben, majd 3 hétig normál étrendben (9 hét + 3 hét csoport), szemben a demielinizációs fázissal cuprizone diéta 9 hétig (9 hetes csoport). (A) A top 10 felfelé és lefelé szabályozott kanonikus útvonal a differenciálisan expresszált oligodendrocita génekből a remyelinizáció során (9w + 3w csoport). A vörös csillag a koleszterinszintézis útvonalát jelzi, mint a remyelinizáció során a legfelső négy felfelé szabályozott út. (B) A hőtérkép több koleszterin-szintézis út génjének felfelé irányuló szabályozását mutatja (vörös) a remyelinizáció során.

A koleszterin-szintézis útvonal génjeinek feljavított expressziójának megerősítése érdekében a remyelinizáció során qPCR-t végeztünk OLC-specifikus RNS-eken, amelyeket egy másik Olig1-RiboTag egér halmazának corpus callosumából izoláltunk. Amint azt az 5A. Ábra szemlélteti, három koleszterinszintézis gént vizsgáltunk, amelyek a koleszterinszintézis fontos enzimeit kódolják, nevezetesen a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-szintáz1 (Hmgcs1), a farnezil-difoszfát-szintáz (Fdps) és a farnesil-difoszfát-farnesil-transzferáz 1-et. (Fdft1). Megállapítottuk, hogy a remyelinizációs fázis alatt a 9w + 3w egerek jelentősen megnövelték a Hmgcs1, Fdps és Fdft1 génexpressziós szinteket (5B. Ábra). Ezután megmutattuk a Hmgcs1, Fdps és Fdft1 fokozott expresszióját fehérjeszinten, immunfluoreszcencia elvégzésével a WT egerekből nyert szöveteken. A HMGCS1, FDPS vagy FDFT1 kettős immunjelölése a CC1 oligodendrocita markerrel szignifikánsan fokozta a koleszterinszintézis fehérje expressziójának növekedését a CC1 + oligodendrocytákban a 9w + 3w egerek corpus callosumában a remyelinizációs fázisban (5. ábra C – E és SI függelék, S4. Ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy az oligodendrociták felfelé szabályozzák a koleszterin-szintézis gén útjait az axonkárosodással járó krónikus demyelinizációt követő remyelinizáció során.

Először az EAE egerekből származó gerincvelő myelinhüvelyének vastagságát értékeltük EM alkalmazásával, hogy bemutassuk az ERβ-ligandum kezeléssel kiváltott remyelinizáció mértékét (6A. Ábra). Az ERβ ligandummal kezelt EAE egereknél a myelinvastagság növekedése és a g-arány csökkenése (az axon átmérője osztva a mielinnel és az axon átmérőjével) a vivőanyag-kontrollokkal összehasonlítva (6. ábra A és C ábra) megerősítette az ERβ-ligand kezelés remyelinizáló hatását az EAE során (9, 16 ⇓ –18). Az EAE-ben végzett ERβ-ligand kezelés során a kevesebb demyelinizáció és a több remyelinizáció közötti további megkülönböztetéshez Cspg4-CreERT2/Mapt-GFP egereket használtunk, amelyek lehetővé teszik az újonnan képződött mielin vizualizálását GFP expresszióval (2). Az EAE ERβ-ligandum kezelésével a GFP-pozitív mielin növekedését figyelték meg (6. ábra B, D és E).

Ezután megvizsgáltuk, hogy az ERβ-ligandum kezelésnek közvetlen hatása van-e az érett oligodendrocytákra. Míg az ERβ-ligandum kezelés szignifikánsan növelte a GSTπ + és CC1 + sejtek százalékos arányát a 9w + 3w/ERβ WT egerekben a 9w + 3w/Veh WT egerekben, ez a védőhatás nem volt jelen a 9w + 3w/ERβ CKO egerekben 9w + 3w/Veh CKO egerek (8. ábra B, C, F és G). Ezután meghatároztuk, hogy az ERβ-ligandum kezelésnek van-e közvetlen hatása az OPC-kre. Míg az ERβ-ligandum kezelés megnövelte az NG2 + OPC-k százalékos arányát a 9w + 3w/ERβ WT egerekben a 9w + 3w/Veh WT egerekben végzett hordozókezeléshez képest, ez a hatás nem volt jelen a 9w + 3w CKO egerekben (8. ábra D és H). Így az ERβ-ligandum kezelés közvetlen hatással volt az OLC-kre a remyelinizáció során a krónikus cuprizone modellben.

Végül meghatároztuk, hogy az ERβ-ligandum kezelés modulálta-e a mikroglia és az asztrocita reaktivitását a krónikus cuprizone modellben az Iba1 + mikroglia és a GFAP + asztrociták aktivációjának felmérésével az MHCII-vel végzett kettős immunjelöléssel. Jelentős növekedést figyeltünk meg az MHCII-expresszáló mikroglia és asztrociták százalékos arányában 9w egerekben a normál kontrollokhoz képest, és szignifikáns csökkenést figyeltünk meg a remyelinizáció során 9w + 3w egerekben, de az ERβ-ligandum és a vivőanyag-kezelés hatása nem volt (SI függelék, S7. Ábra).

A fokozott remyelinizációt a krónikus Cuprizone-modellben a koleszterinszintézis utak további felszabályozása jellemzi OLC-kben ERβ-ligand kezeléssel.

ERβ-kötő profilok humán FDPS-hez és ChIP-vizsgálat egér Fdps génhez. (A) A ösztradiollal kezelt doxiciklin által indukálható ERβ-expresszáló humán MDA-MB-231 sejtek ChIP-seq adatait a GEO adatbázisból szereztük be (belépési szám: GSE108981). Az ERβ ChIP profilok csúcsai jelzik az ERβ kötődését a régióban. Az FDPS csúcsokat mutatott az első exonok körül az ERβ ChIP profilban, míg a negatív kontroll bemeneti profil (a ChIP előtti kromatinból származó DNS) nem mutatta a csúcsot. További negatív kontrollként a PKLR génnek az FDPS gén közelében nem volt csúcsa. (B) Az ERβ az egér Fdps génjének feltételezett ERE-jéhez kötődik. ChIP-t normál egér IgG és anti-ERβ alkalmazásával végeztünk az ER20 ligandummal (DPN) kezelt egér N20.1 oligodendrocita sejtvonalból (21) izolált kromatinra. Két primer készletet terveztek az egész régióban, amely az Fdps gén feltételezett ERE-jét tartalmazza (51).

Vita

Itt RiboTag technológiát alkalmaztunk az oligodendrocytákon belüli molekuláris mechanizmusok vizsgálatára in vivo felnőtt egerek remyelinizációja során, krónikus demyelinizáció két komplementer modelljének felhasználásával axonális degenerációval. Megállapítottuk, hogy a koleszterinszintézis útvonalainak up-regulációja dominálta az OLC-k transzkripciós profilját a felnőtteknél a remyelinizáció során sérülés után.

A kis molekulájú könyvtárak nagy áteresztőképességű in vitro szűrői új jelölteket képesek azonosítani a remyelinizáció in vivo indukciójának tesztelésére (2, 4, 45). Eredményeink azt mutatják, hogy sejtspecifikus és régióspecifikus hatásmechanizmusukat in vivo átfogó módon kell megvizsgálni. Például egy nemrégiben nagy áteresztőképességű in vitro szűrés azonosította az enzimeket célzó molekulákat a koleszterinszintézis útvonalán belül (46). Annak megértése, hogy mely CNS-sejttípusok melyik CNS-régiókat célozzák meg, in vivo az ilyen vegyületekkel végzett kezelés során a mechanizmus megértéséhez és a klinikai vizsgálatok eredményhatásainak összehangolásához szükséges, ha a hatékonyságot végső soron MS-ben kell bizonyítani (12). Ideális esetben a vegyületek nagy áteresztőképességű in vitro szűrését in vivo sejtspecifikus és régióspecifikus génexpresszió követi a mechanizmus érdekében.

Összefoglalva: ez a munka feltárja a sejtspecifikus génexpressziós megközelítés alkalmazásának fontosságát a központi idegrendszerben komplex neurodegeneratív betegségek során, itt betekintést nyerhetünk az oligodendrocyták koleszterin homeosztázisába remyelinizáció során az axonális sérülés hátterében.

Anyagok és metódusok

Az MS-ből származó szövetek nagy áteresztőképességű RNS-szekvenáló elemzése.

Öt, SM-ben szenvedő női nő (átlagéletkor, 57,6 év) és öt női életkornak megfelelő egészséges kontroll (átlagéletkor, 56,2 év) frissen fagyasztott boncolásos agyi szövetmintákat nyertünk az emberi agy és a gerincfolyadék kutatóközpontjából (Los Angeles, Kalifornia). ). A régiók között volt a corpus callosum, az optikai chiasm, a belső kapszula, a hippocampus, a frontális kéreg és a parietalis kéreg. A szekvenálást az Illumina HiSeq3000 készüléken végeztük egy végű 1 × 50 futtatásra. A különböző központi idegrendszeri sejttípusokban a differenciálisan expresszált génszám becsléséhez felsoroljuk a top 500 dúsított gént hét központi idegrendszeri sejttípusban (neuron, mikroglia, asztrocita, endotélia, OPC, újonnan kialakult oligodendrocita és mielináló oligodendrocita) az RNS-szekvenáló transzkriptóm adatbázisból (11) -et használtunk referencia génlistaként (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek).

Állatok.

Az egerek felnőtt nők voltak (8-12 hetes kor), C57BL/6 háttérrel. A B6; 129S4-Olig1tm1 (cre) Rth/J (Olig1-Cre) egereket és a B6N.129-Rpl22tm1,1Psam/J (RiboTag) egereket (14, 19) kereszteztük, hogy Olig1-cre és RiboTag homozigóta egereket kapjunk. Az Olig1-CKO egerek megszerzéséhez a C57BL/6J-ERβ floxolt/floxolt egereket (9) kereszteztük B6-mal; 129S4-Olig1tm1 (cre) Rth/J (Olig1-cre). A Cspg4-CreERT2/Mapt-GFP egerek előállításához a B6.Cg-Tg (Cspg4-cre/Esr1 *) BAkik/J-t kereszteztük B6; 129P2-Mapt/J egerekkel (2). Minden eljárást a Los Angeles-i Kaliforniai Egyetem, a kancellár állatkutatási bizottságának irányelveivel összhangban hajtottak végre (SI melléklet, Kiegészítő anyagok és módszerek).

Cuprizone modell.

A nőstény egerek (8-10 hetes kor) 6 hét vagy 9 hét cuprizone diétát folytattak, hogy kiváltsák a demielinizációt, majd 3 hét normál étrendet követtek el. Az ERβ ligandummal (9) végzett kezelés a normál étrend fázisában történt (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek).

EAE modell.

Aktív EAE-t indukáltak mielin oligodendrocita glikoprotein 35–55 aminosavakkal (12). Az ERβ-ligandum kezelést 1 héttel az EAE indukció előtt kezdték meg, és minden második napon beadták (9). A Cspg4-CreERT2/Mapt-GFP transzgénikus egereknél a tamoxifent (Sigma-Aldrich) kukoricaolajban (75 mg/kg) oldottuk, és s.c. 2 héttel az ERβ-ligand kezelés előtt, öt egymást követő napon át (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek).

Az oligodendrocyták nagy áteresztőképességű RNS-szekvenálása a remyelinizáció során.

Az Olig1-RiboTag egerek szöveteiből Corpus callosum oligodendrocita-specifikus RNS-eket izoláltunk normál egerekből vagy azoktól, akik 9 hét (9 hét csoport) vagy 9 hét héten keresztül normál étrendet, majd 3 hét héten keresztül normál étrendet kaptak. A szekvenálást az Illumina HiSeq3000 készüléken végeztük egy végű 1 × 50 futtatásra. A kanonikus út-dúsítás elemzését minden szövetben, differenciálisan expresszált génekre végeztük, a korábban leírtak szerint (12) (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek) az Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) alkalmazásával.

Standard qPCR módszereket alkalmaztunk a korábban leírtak szerint (9). Az alapozók listáját az SI függelék S5 táblázata tartalmazza (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek).

Szövettani elemzés.

Standard szövettani elemzési módszereket alkalmaztunk a korábban leírtak szerint (9). A részletes módszereket az SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek tartalmazzák. Az immunfluoreszcens festéshez használt antitestek listáját az SI függelék S6. Táblázata tartalmazza.

ERβ ChIP-Seq profilok koleszterinszintézis génekhez.

Ösztradiollal kezelt humán MDA-MB-231 doxiciklin által indukálható ERβ-expresszáló sejtek ChIP-seq adatait a GEO adatbázisból szereztük be (belépési szám: GSE108981) (47). Az emberi genomhoz való igazodáshoz a „QuasR” (48) R csomagot használták (hg19), és az ERβ-kötő profilokat a „GenomicFeatures” (49) és „Gviz” (50) R csomagokból származó bemenettel generálták. Az ERβ ChIP profiljait elemezték koleszterin gének szempontjából (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek).

ChIP-vizsgálat az Fpps ERE-hez való kötődésének felmérésére.

Az immortalizált egér N20.1 oligodendrocita sejtvonalat (21) ERβ ligandummal kezeltük. A ChIP-t EZ-Magna ChIP A/G (Millipore) és ERβ/NR3A2 antitest (Novus Biologicals) alkalmazásával hajtottuk végre. Az Fdps gén feltételezett ERE körüli immunprecipitált DNS-eket (51) PCR-rel amplifikáltuk (SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek).

Adatok elérhetősége.

Az e vizsgálat során generált adatkészletek a GEO adatbázisban (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) a következő belépési számok alatt érhetők el: GSE123496, SM-ben szenvedő nők és életkornak megfelelő egészséges kontrollok (hippocampus, frontális) kéreg, belső kapszula, corpus callosum és parietalis kéreg) (52); GSE100297, MS és kontroll (optikai kiazmus) (53); és GSE118451, Oligo1 RiboTag adatok cuprizone egerekben (54). A módszerek és a statisztikák további részleteit az SI függelék, Kiegészítő anyagok és módszerek tartalmazza.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Roy Kim, Darian Mangu, Eunice Jung, Raul Alejandro-Ramirez, Kevin Herrera és Alexandria S. Hoffman technikai segítségét. Ezt a munkát az NIH Grants R01NS096748 és R01NS109670 (RRV-nek), a Conrad N. Hilton Foundation 20130231 és 20150232 (RRV-nek), a Tom Sherak MS Hope Alapítvány, az Rhoda Goetz MS alapítványa, a Zsidó Közösségi Alap és a Dunk MS Alapítvány. Az emberi szövetmintákat az emberi agyi és gerincfolyadék-erőforrás központból, a VA West Los Angeles Healthcare Center-ből szerezték be, amelyet az NIH, a National Sclerosis Multiplex Society és az Egyesült Államok Veteránügyi Minisztériuma támogat.

Lábjegyzetek

↵ 1 Kinek kell címezni a levelezést. E-mail: rvoskuhlmednet.ucla.edu .

A szerző közreműködései: R.R.V., N.I. és Y.I. tervezett kutatás; N.I., A.T., M.A.M., E.R., V.T., E.J., T.T.S. és Y.I. végzett kutatás; R.R.V., N.I., A.T. és Y.I. elemzett adatok; és R.R.V. és Y.I. írta a lap.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.