A ginkgo biloba kivonat javítja az inzulinjelzést és gyengíti a gyulladást az elhízott patkányok retoperitonealis zsírszövet-raktárában

Bruna Kelly Sousa Hirata

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Brazília

kivonat

Renata Mancini Banin

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Brazília

Ana Paula Segantine Dornellas

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Brazília

Iracema Senna de Andrade

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Brazília

Juliane Costa Silva Zemdegs

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Brazília

Luciana Chagas Caperuto

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Brazília

Lila Missae Oyama

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Brazília

Eliane Beraldi Ribeiro

2 Departamento de Fisiologia, Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Botucatu, 862 Vila Clementino, São Paulo, SP, Brazília

Monica Marques Telles

1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua Arthur Riedel, 275 Eldorado, 09972-270 Diadema, SP, Brazília

Absztrakt

Az elhízás és az ezzel összefüggő rendellenességek magas előfordulási gyakorisága és súlyossága miatt nagyon kívánatos új stratégiákat kidolgozni annak kezelésére vagy akár megelőzésére. Korábban leírtuk, hogy a Ginkgo biloba kivonat (GbE) javította az elhízott patkányok inzulinrezisztenciáját és csökkentette a testtömeg-növekedést. Jelen tanulmányban a GbE hatását értékeltük mind a gyulladásos kaszkádra, mind az inzulinjelzésre az étrend okozta elhízott patkányok retroperitoneális zsírraktárában. A patkányokat 2 hónapig magas zsírtartalmú táplálékkal etették, majd 14 napig 500 mg/kg GbE-vel kezelték őket. Ezután a patkányokat elpusztítottuk, és a retroperitoneális zsírraktárból származó mintákat használtuk a Western blot, RT-PCR és ELISA kísérletekhez. A GbE kezelés mind a táplálék/energia bevitel, mind a testtömeg-gyarapodás jelentős csökkenését segítette elő a kezeletlen elhízott patkányokhoz képest. Ezenkívül mind az Adipo R1, mind az IL-10 génexpresszió, valamint az IR és Akt foszforiláció szignifikáns növekedését figyelték meg, míg az NF-KB p65 foszforiláció és a TNF-α szintje szignifikánsan csökkent. Adataink arra utalnak, hogy a GbE potenciálisan terápiás lehet az elhízással összefüggő anyagcsere-betegségek kezelésében, különös tekintettel a táplálkozási oktatási program betartására rezisztens elhízott alanyok kezelésére.

1. Bemutatkozás

Az elhízás és a túlsúly előfordulása drámaian növekszik az egész világon. 2008-ban a világ népességének 35% -a volt túlsúlyos, míg 11% -a elhízott [1]. Ezenkívül becslések szerint az elhízás a lakosság egyharmadát éri el 2030-ban [2]. Ez a perspektíva különösen aggasztó, mivel az elhízás krónikus társbetegségekhez kapcsolódik, például inzulinrezisztenciához, 2-es típusú cukorbetegséghez (T2D), szubklinikai gyulladáshoz és másokhoz [3].

Feltételezték, hogy a magas zsírtartalmú étrend fogyasztása közvetlenül részt vesz az elhízás patogenezisében, mivel befolyásolja az élelmiszer-bevitel központi szabályozását és a perifériás anyagcserét, ami fokozott testtömeg-növekedést, inzulinrezisztenciát és egyéb anyagcserezavarokat eredményez [4, 5] . Így korábban bebizonyítottuk, hogy a hosszan tartó hiperlipid étrend bevitele elősegítette a patkányokban a test adipozitásának, a triacil-glicerin és a glükóz plazmaszintjének jelentős növekedését az inzulinérzékenység egyidejű csökkenésével [6].

Az inzulinrezisztencia krónikus állapot, amelyben az inzulin hormon nem képes aktiválni saját jelátviteli kaszkádját, ami hiperglikémiát eredményez. Nagyon szoros összefüggésben van a zsigeri zsírfelesleg-felesleggel és a citokinek, például a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-a) és az interleukin-6 (IL-6), fokozott fehér zsírszövet (WAT) expressziójával [3, 7]. Továbbá a magas zsírtartalmú étrend bevitelét az inzulinrezisztencia fontos kockázati tényezőjeként emelték ki, mivel mind az inzulin jelátviteli utat rontja, mind a gyulladást serkenti a Toll-szerű receptorok révén, amelyek kaszkádot jeleznek [5, 7, 8].

Figyelembe véve, hogy a hipoglikémiák többségének nemkívánatos mellékhatásai vannak [9–12], és az inzulinrezisztencia progressziójának súlyossága miatt nagyon kívánatos új gyógyszerek és kezelési módszerek felfedezése. Felvetődött, hogy a ginkgo biloba kivonat (GbE) pozitív hatással lehet a hiperglikémiára. Ez a növényi kivonat főleg körülbelül 24% flavonoid-glikozidot és 6% terpenoidot tartalmaz, beleértve az A, B, C, M, J, P és Q ginkgolidokat [13].

Korábban leírtuk, hogy a hosszan tartó GbE-kezelés jelentősen csökkentette a táplálékfelvételt és a test adipozitását, megakadályozta a hiperglikémiát és a diszlipidémiát, miközben növelte az ITT (inzulin-tolerancia-teszt) által értékelt inzulinérzékenységet elhízott patkányokban, amelyeket disznózsírral dúsított hiperlipidikus táplálékkal etettek [6]. Korábbi megállapításainkkal egyetértésben más tanulmányok azt javasolták, hogy a GbE bevitele javította mind az egészséges, mind a T2D betegek glikémiás profilját [14, 15]. Ezenkívül a szacharin szerek orális beadásával stimulált glükózszint emelkedést patkányokban igazolták [16].

A fenti adatok a GbE inzulinrezisztenciára és az elhízással kapcsolatos rendellenességekre gyakorolt ​​jótékony hatásaira utalnak. Nagyon fontos azonban jobban leírni azokat a mechanizmusokat, amelyek révén a GbE javítja az inzulin hatást. Ebben a kontextusban a jelen tanulmány célja annak értékelése volt, hogy egy 14 napos orális GbE kezelés megváltoztatja-e a retroperitoneális WAT depot inzulint és a Toll-szerű receptorokat, amelyek jelzik az étrend okozta elhízott patkányok kaszkádjait, az inzulinrezisztencia modelljét.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

Az Universidade Federal de São Paulo Állatkutatási Etikai Bizottsága jóváhagyta az ebben a vizsgálatban használt állatok gondozására vonatkozó összes eljárást (eljárásszám: 271359). Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében. A CEDEME-ből származó hím Wistar patkányokat (São Paulo, Brazília) ketrecenként 4-en tartották, és ellenőrzött fény (12: 12-órás világos/sötét, világítás 6-kor) és hőmérsékleti (23 ° C ± 1 ° C) körülmények között tartották., ingyenes hozzáféréssel az élelmiszerekhez és a vízhez.

A 2 hónapos patkányokat zsírral dúsított étrenddel etették, amelyet 40% (w/w) standard chow és 28% (w/w) zsír, 2% (w/w) szójaolaj, 10% hozzáadásával készítettek. (w/w) szacharóz, 20% (w/w) kazein, a kontroll étrend fehérjetartalmának elérése érdekében, és butilezett hidroxi-toluol a további olaj 0,02% (w/w) mennyiségében. Ez 19,5% energiát adott szénhidrátként, 23,2% fehérjét és 57,3% zsírot. Az 1. táblázat az étrend makro- és zsírsav-összetételeit mutatja be.

Asztal 1

Magas zsírtartalmú étrend makrotápanyagok és zsírsavösszetételek.

Magas zsírtartalmú étrend
Páratartalom (%)1.1
Lipid (%)31.6
Fehérje (%)27.0
Szénhidrát (%)27.5
Összes élelmi rost (%)8.6
Rögzített ásványi maradék (%)4.2
Nátrium-klorid (%)0.2
Számított energia (Kcal/g)5.0

8 hét után az állatokat két csoportra osztották, az alábbiakban ismertetett fitoterápiás kezelésnek megfelelően.

2.2. Fitoterápiás kezelés

A ginkgo biloba kivonatot (GbE) a Southern Anhui Dapeng-től (Kína) nyerték, és tartalmazott 26,12% flavon-glikozidot, 6,86% terpenoidot, 2,20% A ginkgolidot, 1,11% B ginkgolidot, 1,05% C ginkgolidot és 2,50% bilobalid.

A fitoterápiás kezelést 14 napig végezték. Az elhízott állatokat két csoportra osztották: O + V (elhízott + vivőanyag) és O + Gb (elhízott + Ginkgo biloba). Az O + Gb csoportot naponta 500 mg/kg GbE-vel [17, 18] 1 ml 0,9% -os sóoldattal (vivőanyag) hígítva, míg az O + Gb-t 1 ml vivőanyaggal hígítottuk.

2.3. Testtömeg-gyarapodás, felhalmozott élelmiszer- és energiafelvétel

A fitoterápiás kezelési periódusban napi 24 órás táplálékfelvételt és testtömeget mértek. A táplálékbevitel értékelését a kínált étkezés mennyisége és a maradék 24 óra elteltével történő különbsége alapján számoltuk ki.

A testtömeg-növekedést a végső testsúly (a kezelés utolsó napja) és a kezdeti súly (a kezelés első napja) közötti különbség alapján számoltuk ki. A felhalmozott élelmiszer- és energiafogyasztást a kezelés első 13 napjának átlagával mértük. A kezelés utolsó napján a patkányokat egy éjszakán át éheztettük.

2.4. Retroperitonealis zsírszövet és szérum paraméterek

A patkányokat nátrium-tiopentallal (80 mg/kg testtömeg, intraperitoneálisan) érzéstelenítettük, és 10 órás éhezési időszak után lefejeztük. A retroperitonealis fehér zsírszövet depót eltávolítottuk és 1,0 ml lízispufferben (100 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA és 0,1 mg/ml aprotinin, 2 mM PMSF, 10 mM nátrium-ortovanadát, 100 mM nátrium-fluorid, homogenizáltuk). 10 mM nátrium-pirofoszfát és 10% TritonX-100). A proinflammatorikus citokin TNF-α és gyulladáscsökkentő citokin IL-10 szintjét ELISA kit segítségével mértük (R&D Systems).

Az adiponectin méréséhez a Milliplex MAP (Millipore) portálvénás vért is gyűjtöttünk.

2.5. Western Blotting

A patkányokat nátrium-tiopentallal (80 mg/kg testtömeg, intraperitoneálisan) mélyen altattuk. A hasüreget kinyitották, és negatív kontrollmintákat (O + V− és O + Gb−) nyertünk a bal oldali retroperitoneális zsírraktárból. A begyűjtés után a mintákat azonnal egy 3,0 ml lízispuffert (100 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA és 0,1 mg/ml aprotinin, 2 mM PMSF, 10 mM nátrium-ortovanadát, 100 mM nátrium-fluorid, 100 mM nátrium-ortovanadát, 100 mM nátrium-fluorid, 1 mmol/l) tartalmazó ampullába helyeztük. 10 mM nátrium-pirofoszfát és 10% TritonX-100), homogenizált és 16000 g-vel 40 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. Ezután a portális vénát kitettük, és 10-5 M inzulint injektáltunk intravénásán (i.v.). A jobb oldali retroperitoneális zsírraktárt 90 másodperccel az iv. inzulininjekció (pozitív minták: O + V + és O + Gb +) a fent leírt protokoll szerint [19, 20]. Az összes fehérjét BCA kit (BioRad) segítségével számszerűsítettük, és mintákat használtunk mind immunprecipitációra, mind teljes kivonat értékelésére.

A nem specifikus antitestkötés kockázatának csökkentése érdekében értékeltük az IR foszforilációs szintjét az IR elleni antitesttel történő immunprecipitáció után. Az immunprecipitációs kísérletek elvégzéséhez a mintákat egy éjszakán át 10 µl primer antitest-anti-IR-vel (Rβ sc-711 inzulin) inkubáltuk, és a fehérjéket Protein A Sepharose (GE) segítségével kicsaptuk. Végül is a fehérjéket elválasztottuk 10% SDS-PAGE-n. A fehérjéket ezután nedves transzfer berendezéssel (Bio-Rad) vitték át a nitrocellulóz membránokra. A membránokat 1 órán át blokkoló pufferben (5% szarvasmarha szérum albumin [BSA], 1 M Tris, pH 7,5, 5 M NaCl és 0,02% Tween-20) inkubáltuk. A membránokat egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a p-Tyr elleni elsődleges antitesttel (Cell Signaling 8954). Ezután az összes membránt inkubáltuk specifikus torma-peroxidázzal konjugált anti-nyúl IgG antitesttel (Cell Signaling 7074), majd kemilumineszcencia detektálással (Amersham Biosciences). Mivel az összes mintát IR antitesttel immunprecipitáltuk, úgy véltük, hogy a 95 kDa molekulatömegű sávok összefüggésben vannak az IR foszforilezett formájával. Ezenkívül IR-szinteket használtunk belső standardként, mivel az összes többi fehérjét eltávolítottuk immunprecipitációs módszerrel.

A teljes extraktumkísérletek elvégzéséhez a fehérje mennyiségi meghatározása után az összes fehérjét elválasztottuk 8% SDS-PAGE-n. A fehérjéket félszáraz transzfer készülékkel (Bio-Rad) vittük át.

Az összes membránt egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on a foszfo-Akt elleni elsődleges antitesttel (Cell Signaling Ser 473–9271); Akt (Cell Signaling 9272), foszfo-NF-KB p65 (Cell Signaling Ser 536–3033), NF-KB p65 (Cell Signaling 6956), MyD88 (Cell Signaling 4283), TLR4 (SC 293072) és β-tubulin ( Sejtjelzés 2146). Ezután az összes membránt inkubáltuk specifikus torma-peroxidázzal konjugált anti-egér/nyúl IgG antitesttel (Cell Signaling 7076; Cell Signaling 7074, ill.), Majd kemilumineszcencia detektálással (Amersham Biosciences). Belső standardként a β-tubulin (Cell Signaling 2146) szintet használtuk.

A kvantitatív elemzést Scion Image szoftverrel (Scion Corporation, Frederick, MD, USA) végeztük. Valamennyi kísérletben minden csoportból legalább egy mintát elemeztek egyidejűleg, és az eredményeket százalékos változásként fejeztük ki az alapszintekhez viszonyítva.

2.6. RNS extrakció és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qPCR)

Az Adipo R1, Adipo R2 és IL-10 génexpressziójának kiértékeléséhez további öt (O + V és O + Gb) csoportot hajtottunk végre. A teljes RNS-kivonáshoz minden mintából kétszáz mg fagyasztott retroperitoneális zsírszövetet homogenizáltunk 1 ml Trizol-reagens (Invitrogen, USA) hozzáadásával. A mintákat 16 000 g-vel 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, a vizes fázist eltávolítottuk és 0,5 ml izopropil-alkohollal összekevertük. Miután 16 000 g-vel 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, az üledéket 1 ml 75% -os etanollal mostuk, majd 20 ul DEPC-vel kezelt vízben oldottuk (Ambion, USA).

Egy mikrogramm RNS-t fordítottunk át cDNS-be a High-Capacity cDNS kit (Applied Biosystems) segítségével. A génexpressziót valós idejű qPCR-rel értékeltük Taqman PCR Assays segítségével. Az alapozók és a szondák katalógusszáma az Adipo R1 (Rn01483784_m1), az Adipo R2 (Rn01463173_m1), az IL-10 (Rn00563409_m1) és az Actin b (Rn00667869_m1) volt.

A reakciókat 96 lyukú lemezeken hajtottuk végre, és három példányban hajtottuk végre őket. Az amplifikációs körülmények 40 ciklusból álltak: 50 ° C/2 perc, 95 ° C/10 perc, 95 ° C/15 s és 60 ° C/1 perc. A 2. −ΔΔCt módszert alkalmaztuk az amplifikációs termékek relatív mennyiségi meghatározásának értékelésére.

2.7. Statisztika

A statisztikai elemzést a PASW Statistics 19. verziójával (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) végeztük, a statisztikai szignifikancia szintjét P-nél (1. ábra) a). Érdekes megjegyezni, hogy az O + Gb csoport 6,3% -kal kevesebbet fogyasztott, mint az O + V csoport (P = 0,031). Az energiafogyasztással kapcsolatban az 1. (b) ábrán megfigyelhető, hogy az O + Gb szintén jelentős, 6,3% -os csökkenést mutatott az O + V-hez képest (P = 0,031).