A gombaellenes gyógyszer mikonazol enyhítette a memóriahiányt az LPS által kiváltott memóriavesztés egérmodelljében az iNOS célzása révén

Tárgyak

Absztrakt

Bevezetés

A demenciát, az életkorral összefüggő betegséget a memória, a beszéd, a problémamegoldás és más kognitív képességek nehézségei jellemzik 1. A demenciának sokféle típusa van, beleértve az Alzheimer-kórt (AD), a Lewy-test demenciáját, a kevert demenciát és az érrendszeri demenciát 1,2. Az élettartam növekedésével a demenciában szenvedő betegek száma folyamatosan növekszik, de a jelenleg alkalmazott acetilkolin-észterázt gátló gyógyszerek csak késleltetik a tünetek progresszióját, és nincs gyógyító kezelés 3. Az amiloid-béta vagy a foszfo-tau ellen egyéb terápiás szereket fejlesztettek ki célgyógyszerként; a klinikai vizsgálatok azonban nem jártak sikerrel 4. Ezért új irányú terápiás gyógyszerek kifejlesztésére van szükség.

Az azol gyógyszereket általában gombaellenes szerként használták, és fő tevékenységük a gombasejtek membránszintézisének gátlása 17. Érdekes módon ezek a gyógyszerek állítólag gátolják az iNOS 18,19 expresszióját. Számos jelentés kimutatta, hogy az MCZ neuroprotektív hatása, például a remyelinizáció 20, megvédi az ereket a repedéstől és a gyulladástól a hemorrhagiás stroke 21-ben, és bebizonyosodott, hogy az MCZ az egerek intraperitoneális beadását követően átjut a vér-agy gáton 22. A lipopoliszacharid (LPS) olyan molekula, amelyet tipikusan használnak az iNOS jelátvitel előidézésére; Az LPS expozíció tehát növelheti az iNOS expresszióját és a neuroinflammációt a neuronális sejtekben 23, 24, 25. Tehát egy állatkísérlet során intraperitoneális LPS injekciót alkalmaztak kognitív károsodási modell kiváltására egerekben 26,27,28,29 .

Annak megvizsgálására, hogy az azol gyógyszerek hasznosak lehetnek-e az AD számára az iNOS expresszió gátlásával és a következményes ideggyulladással, MCZ-t, egy azol gyógyszert adtunk be, és bioinformatikai elemzés alapján értékeltük az anti-AD hatást és annak aktív mechanizmusát (1. kiegészítő ábra).

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

Összesen 40 felnőtt, 8 hetes hím C57BL6/N hím egeret (20–25 g) vásároltunk a Daehan Biolink-től (Chungcheongbuk-do, Korea), és az Országos Toxikológiai Kutatóintézet és Koreai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal a laboratóriumi állatok humánus gondozásáért és felhasználásáért. A jelen vizsgálatban szereplő összes kísérleti eljárást a Chungbuk Nemzeti Egyetem IACUC-ja hagyta jóvá (jóváhagyási szám: CBNUA-1088-18-01). Az állatokat egy olyan helyiségben helyezték el, amelyet automatikusan 21–25 ° C-on tartottak, 45–65% relatív páratartalommal és 12 órás szabályozott világos-sötét ciklussal. A memória károsodásának kiváltására az egereket véletlenszerűen négy csoportba soroltuk. 1. csoport (kontrollcsoport; n = 8) kapott sóoldatokat és 2. csoportot (MCZ csoport; n = 8) MCZ-t kapott (40 mg/kg), 3. csoport (LPS csoport; n = 12) kapott LPS-t (250 μg/kg/nap), 4. csoport (MCZ + LPS csoport; n = 12) mindkettőt megkapta. Az összes injekciót 7 napon keresztül intraperitoneálisan adtuk be. A gyógyszer koncentrációját és az alkalmazás módját más kutatási cikkekbe utalták, amelyek az agy MCZ-koncentrációját mutatják i.p. injekció 22,26 .

Anyagok

A mikonazolt, a flukonazolt és a Clotrimazole, az Egyesült Államok Pharmacopeia (USP) referencia standardját, valamint az Escherichia coli O111: B4-ből származó lipopoliszacharidokat és más vegyszereket a Sigma-Aldrich-től (USA) szereztük be.

Morris vízlabirintus

A Morris vízi labirintus teszt széles körben elfogadott módszer a kognitív funkciók vizsgálatára, és ezt a jelen tanulmányban alkalmazták a korábban leírt módon 30. Röviden: egy kör alakú műanyag medencét (magassága 35 cm, átmérője 100 cm) megtöltötték vízzel (plusz fehér festékkel), amelyet 22-25 ° C-on tartottak. Egy menekülési platform (14,5 cm magasság, 4,5 cm átmérő) 1–1,5 cm-rel a víz felszíne alá került. A vizsgálatot naponta háromszor, 5 napon keresztül végeztük el a megszerzési szakaszban (1–5. Nap), három randomizált kiindulási ponttal. A menekülési platform helyzete állandó volt. Mindegyik kísérlet 60 másodpercig tartott, vagy véget ért, amint az egerek elérték a víz alá került platformot. Az egyes egerek úszási mintázatát a medence közepe fölé szerelt kamera követte és rögzítette, a menekülési késést, a menekülési távolságot és az úszási sebességet a SMART-LD program (Panlab, Spanyolország) értékelte. Csendes környezetet, állandó vízhőmérsékletet tartottak fenn a kísérleti időszak alatt.

Szonda teszt

A memória konszolidációjának felmérése érdekében 24 órával a vízlabirintus teszt után (azaz a 6. napon) próbatesztet hajtottak végre. A próbateszthez az emelvényt levették a medencéről, és az egerek szabadon úszhattak. Minden egér úszási mintázatát 60 másodpercig figyeltük és rögzítettük a SMART-LD program (Panlab) segítségével. Az összevont térbeli memóriát a célnegyed területén töltött idő becsülte meg.

Passzív elkerülés teljesítményteszt

A passzív elkerülés válaszát egy „lépésenkénti” készülékkel (Med Associates, USA) határoztuk meg, amely egy megvilágított rekeszre és egy sötét rekeszre (egyenként 20,3 × 15,9 × 21,3 cm) van osztva, amelyek egy kis rácsos kapun keresztül csatlakoznak egymáshoz. padló, 3,175 mm rozsdamentes acél rudak 8 mm-re vannak egymástól. Huszonnégy a próba teszt után (vagyis a 7. napon) 3 perc szoktatás a kapun nyitott kamrában sokk nélkül. Negyvennyolc órával a próba teszt után (azaz a 8. napon) egy edzéspróbát hajtottak végre. Az egereket a megvilágított rekeszbe tették, a sötét rekesztől eltekintve az edzéshez. Amikor az egerek teljesen a sötét rekeszbe költöztek, áramütést kapott (0,4 mA, 3 s időtartam). Ezután az egereket visszatették a ketrecükbe. Huszonnégy órával az edzés után (azaz a 9. napon) minden egeret a megvilágított rekeszbe helyeztünk és megmértük a késleltetési periódust, hogy beléphessünk a „retenciónak” meghatározott sötét rekeszbe. Azt az időt, amikor az egerek beléptek a sötét rekeszbe, feljegyeztük és átmeneti késleltetésnek neveztük. A retenciós kísérleteket 180 másodperces határidővel határoztuk meg.

Agygyűjtés és megőrzés

A viselkedési tesztek után az egereket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, pH 7,4) perfundáltuk heparinnal inhalációs CO2 altatásban. Az agyakat azonnal eltávolították a koponyákból, és felosztották őket bal és jobb agyra. Az egyiket -80 ° C-on tároltuk, a másikat 4% paraformaldehidben rögzítettük 72 órán át 4 ° C-on, és 30% -os szacharóz-oldatokba helyeztük.

Nyílt terepi teszt

A mozgásszervi aktivitást 61 × 61 cm-es szabadtéren teszteltük (n = Csoportonként 6). Az egereket egymástól függetlenül az aréna egyik sarkába helyeztük, és a vízszintes mozgásokat 30 percig rögzítettük az Any-Maze Behavior Video Tracking Software SMART-LD programmal (Panlab). A szabadtér kamráját a kísérletek között 70% v/v alkoholos oldattal tisztítottuk.

Aβ1–42 által kiváltott állatkísérlet

Nyolc-10 hetes hím C57BL6/N egereket (Daehan Biolink, Chungcheongbuk-do, Koreai Köztársaság) tartottak fenn és kezeltek a koreai FDA humánus állatgondozási és használati irányelveivel összhangban. Az infúziós egér modelljét a patkány infúziós modellen végzett korábbi munka során adaptálták. A memória károsodásának kiváltására az egereket véletlenszerűen három csoportba soroltuk. 1. csoport (kontrollcsoport; n = 10) 7 nappal a műtét után fiziológiás sóoldatot kapott és a 2. csoportot (Aβ infúzió; n = 10) 7 nappal a műtét után sóoldatot kapott, 3. csoport (Aβ infúzió; n = 10) MCZ-t (40 mg/kg/nap) kaptak 7 nappal a műtét után. Az érzéstelenített állatokat sztereotaxiás készülékbe helyeztük, és katétereket csatlakoztattunk egy ozmotikus miniszivattyúhoz (Alzet 1002, ALZA, Mountain View, CA, USA) és egy 1 agyi infúziós készlethez (Alzet készlet 3-5 mm, ALZA). a következő koordináták szerint ültettük be: egér (egyoldalúan): -1,0 mm elülső/hátsó, +0,5 mm mediális/laterális és -2,5 mm háti/ventrális. A szivattyú tartalmát 14 nap alatt szabadítottuk fel, amely 300 pmol összesített Aβ1–42-et (Bachem Chemical, Torrance, CA, USA) tartalmazott steril sóoldatban (0,9% NaCl) feloldva. A tanulás és a memória kapacitásának tesztjeit ezután három teszt (vízlabirintus, szonda és passzív elkerülés teszt) segítségével értékelték.

Asztrociták és mikroglia BV2 sejtek tenyésztése

Immunhisztokémiai festés

Miután 30% -os szacharóz-oldatba helyeztük, az agyakat paraffinviaszba ágyazottuk, rutinszerűen feldolgoztuk, majd rotációs mikrotóm alkalmazásával 10 μm vastag szeletekre osztottuk (Leica RM 2125 RTS, Szingapúr). A metszeteket GFAP (Santa cruz, # sc-33673), Iba-1 (Wako, # 019-19741), iNOS (Thermo, # PA3-030A), COX-2 (abcam, # ab52237) antitesttel (1) bionilezték.: 100) éjszakai inkubáció 4 ° C-on, és anti-IgG torma-peroxidáz (HRP) másodlagos antitestek (1: 500; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), 1 óra 30 perc inkubáció szobahőmérsékleten . Kromogén DAB (Vector Laboratories) reakcióval vizualizált agyi szakaszok akár 10 percig és hematoxilinnel 30 másodpercig ellenfestettek. Végül az agyi szakaszokat etanolban dehidratáltuk, xilolban tisztítottuk, Permount-tal (Fisher Scientific, Hampton, NH) szereltük fel, és fénymikroszkóppal értékeltük (Microscope Axio Imager. A2, Carl Zeiss, Oberkochen, Németország) (× 50 és × 200).

Western blottolás

RNS izolálás és kvantitatív valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR)

A szöveti RNS-t izoláltuk homogenizált hippokampuszból RiboEX (Gene All, Szöul, Korea) alkalmazásával, és az összes RNS-t (0,2 μg) reverz transzkripcióval komplementer DNS-be (cDNS) írtuk le a gyártó utasításainak megfelelően, az Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) alkalmazásával. . A kvantitatív, valós idejű, reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakció (PCR) vizsgálatokhoz az iNOS, tumor necrosis factor (TNF) -α, interleukin (IL) -1β, IL-6 és GAPDH cDNS-ek amplifikációinak linearitását meghatároztuk. előzetes kísérletekben állapították meg. Az összes szignál mRNS-t normalizáltuk GAPDH mRNS-re. A cDNS-eket valós idejű PCR-rel amplifikáltuk duplikátumban QuantiNova SYBR zöld PCR-készlettel (Qiagen, Valencia, CA, USA). Mindegyik mintát a következő primer készletekkel futtattuk: miNOS, 5ʹ-TGACGCTCGGAACTGTAGCAC-3ʹ (érzék), 5,-TGATGGCCGACCTGATGTT-3ʹ (antiszensz); mTNF-a, 5ʹ-TGTAGCCCACGTCGTAGCAA-3ʹ (érzék), 5ʹ-AGGTACAACCCATCGGCTGG-3ʹ (antiszensz); mIL-1β, 5ʹ-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3ʹ (érzék), 5ʹ-ATGTGCTGCTGCGAGATTTG-3ʹ (antiszensz); mIL-6, 5ʹ-CCACTTCACAAGTCGGAGGC-3ʹ (érzék), 5ʹ-GCCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3ʹ (antiszensz); mGAPDH: 5ʹ-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3ʹ (értelmes), 5ʹ-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3ʹ (antiszensz).

Citokinvizsgálat

Az egér TNF-α, IL-6 és IL-1β szöveti szintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készletekkel mértük, amelyeket R&D rendszerek (Minneapolis, MN, USA) biztosítottak a gyártó protokollja szerint.

Nitritvizsgálat

Az asztrocitákat és a mikroglia BV2 sejteket 3x105 sejt/lyuk sűrűségben szélesztettük 6 lyukú lemezeken 2 ml tápközegben 24 órán át. A táptalaj eltávolítása után a sejteket 24 órán át 2 ml tápközegben LPS-sel (1 μg/ml) és mikonazollal (1,25, 2,5, 5, 10 μM) kezeltük. A felülúszó nitritjét NO detektáló készlet (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) alkalmazásával értékeltük a gyártó utasításainak megfelelően. Végül a kapott színt 520 nm-en vizsgáltuk mikrotányér abszorbancia-leolvasóval (VersaMax ELISA, Molecular Devices, Kalifornia, USA).

Plazmid vektor és luciferáz aktivitás vizsgálata

A BV2 sejteket 12 üreges lemezekre szélesztettük (1x105 sejt/üreg), és átmenetileg pNF-KB-Luc plazmiddal transzfektáltuk az NF-kB aktivitás értékelésére (5x NF-KB; Stratagene, La Jolla, CA ), iNOS promóter kettős riporter (MPRM38938-LVPG04) és negatív kontroll (NEG-LVPG04) lentivirális plazmid vektorok, amelyeket a GeneCopoeia (Rockville, MD, USA) vásárolt, 20 nM plazmid és Lipofectamine 3000 reagens keverékével OPTI-ben -MEM, a gyártó specifikációja szerint (Invitrogen). A transzfektált sejteket LPS-sel (1 μg/ml) és különböző koncentrációjú (1,25, 2,5, 5, 10 μM/ml) mikonazollal kezeltük 12 órán át. A luciferáz aktivitást a Secrete-Pair ™ Dual Luminescence Assay kit (Genecopoeia, Rockville, MD, USA) segítségével mértük, és az eredményeket luminométeren olvastuk le, a gyártó specifikációi szerint (WinGlow, Bad Wildbad, Németország).

Lehúzható teszt

A BV2 sejt lizátumot konjugáltuk epoxi-aktivált 6B szefarózzal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Az iNOS-t (1 mg) feloldjuk 1 ml kapcsolópufferben (35% DMSO és 0,5 M NaCl, pH 8,3). Az epoxiddal aktivált 6B szefarózt megduzzasztottuk, és 1 mM sósavban szinterezett üvegszűrőn át mostuk, majd kapcsolópufferrel mostuk. Epoxi-aktivált 6B sepharose gyöngyöket adunk az MCZ-t tartalmazó kapcsolópufferhez, és 24 ° C-on 4 ° C-on inkubáljuk. Az iNOS-konjugált sepharose 6B-t három cikluson keresztül váltakozó pH-értékű mosópufferekkel mossuk (1. puffer, 0,1 M acetát és 0,5 M NaCl, pH 4,0; 2. puffer, 0,1 M Tris-HCl és 0,5 M NaCl, pH 8,0). Az iNOS-konjugált gyöngyöket ezután kötőpufferrel (0,05 M Tris-HCl és 0,15 M NaCl, pH 7,5) egyensúlyoztuk. A kontroll konjugálatlan epoxi-aktivált sepharose 6B gyöngyöket a fent leírtak szerint állítottuk elő iNOS hiányában. A sejtlizátumot iNOS-konjugált 6B vagy 6B szefarózzal kevertük 4 ° C-on 24 órán át. A gyöngyöket ezután háromszor mossuk Tris-pufferolt sóoldattal és Tween 20-mal (TBST). A megkötött fehérjéket SDS betöltő pufferrel eluáltuk. Ezután a fehérjéket SDS-PAGE-val választottuk el, majd immunblottot végeztek iNOS elleni antitestekkel (1: 1000, Novus Biologicals, Inc., Littleton).

Beállítási eljárás

Az MCZ és az iNOS közötti dokkolási vizsgálatokat Autodock VINA segítségével végeztük. Az iNOS-7-nitrodazolhoz kötött komplexek háromdimenziós struktúráit a Protein Data Bankból nyertük le [PDB: 1M8E], és az iNOS háromdimenziós szerkezetét a Chem3D és a ChemDraw segítségével építettük fel, amelyet az AutodockTools alkalmazásával tovább készítettünk. A rácsdoboz középpontja az iNOS monomer volt, és a rácsdoboz méretét úgy állítottuk be, hogy az magában foglalja a teljes monomert. A legjobb kötési modell molekuláris grafikáját a Discovery Studio Visualizer segítségével készítettük.

Fluoreszcens mikroszkópia

A rögzített sejteket a következő primer antitesteknek tettük ki: p65 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), szobahőmérsékleten 2 órán át. Inkubálás után a sejteket jéghideg PBS-sel kétszer mostuk, és az Alexa Fluor 568 nm-hez konjugált anti-egér szekunder antitesttel (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA) inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át. Az immunfluoreszcencia képeket K1-Fluo lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal (Nanoscope Systems, Daejeon, Korea) készítettük.

A sejtek életképességének vizsgálata

Mindegyik sejtvonalat (mikroglia BV2 és tenyésztett asztrociták 1 × 104 sejt) 24 órán át tenyésztettük, majd 24 órán át LPS-sel (1 μg/ml) és/vagy mikonazollal (1,25, 2,5, 5, 10, 20 μM) kezeltük. h. 24 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után DMT-tápközegben hígított MTT-t (3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromidot; Sigma, St. Louis, MO, USA) adtunk hozzá. minden egyes üregbe, és az inkubálást 90 percig végeztük. Ezután a felülúszót eldobtuk, és a kristálytermékeket DMSO-val eluáltuk (200 μl/üreg; Sigma, St. Louis, MO, USA). A kolorimetriás értékelést spektrofotométerrel végeztük 540 nm-en a sejtnövekedés detektálása céljából.

Bioinformatika

Használja a nyílt forráskódú Nyitott célok platformot (www.targetvalidation.org) és a Betegség-kapcsolatot (disease-connect.org).

Statisztikai analízis

Az adatokat a GraphPad Prism v5.0 alkalmazásával elemeztük. Az összes adatot normális eloszlás szempontjából megvizsgáltuk D’Agostino & Pearson normalitási teszttel. Ha az adatkészlet normális eloszlást mutat, akkor a párosítatlan kétfarkú diákoké t-tesztet vagy kétirányú ANOVA-t ismételt mérésekhez és Bonferroni post-hoc elemzést használtunk. Ha az adatsor nem mutat normális eloszlást, akkor kétfarkú Mann – Whitney U-tesztet alkalmaztunk. A megfelelő állatmodell biztosítása érdekében a kezdeti tapasztalatokat (véletlenszám-táblázat módszer) mindegyik csoporthoz hozzárendeltük a korábbi tapasztalatoknak megfelelően (figyelembe véve az egér mortalitását és a sikeres modellalapítást). Az adatok nem tartalmaztak embereket, ezért nem használtunk rolót ehhez a kísérlethez. Az adatokat átlag ± S.E.M. Az összes kísérletet három példányban hajtottuk végre.

Eredmények

A mikonazol javítja a memória romlását az LPS-sel kezelt egerekben

A mikonazol csökkenti a neuroinflammációt az LPS-sel kezelt egerek agyában

A túlzott ideggyulladás az asztrociták és a mikroglia sejtek aktiválásával befolyásolja a memóriavesztést. Ezért immunhisztokémiát (IHC) és Western blot-ot végeztünk a gliasejtek GFAP (asztrociták markere), Iba-1 (mikroglia markere) és az agyban található iNOS és COX-2 gyulladásos fehérjék általi aktivációjának kimutatására. Az MCZ-vel kezelt egerek kevesebb GFAP-reaktív és Iba-1-reaktív sejtet mutattak az agyban, mint az LPS-vel injektált egerek (a teljes elemzéshez 2a., B. Ábra és 4A., B. Kiegészítő ábra). A gyulladásos fehérjék (iNOS és COX-2) reaktív sejtjei szintén alacsonyabbak voltak az MCZ + LPS-sel kezelt egerek agyában, mint az LPS + sóoldattal kezelt egerek agyaiban (2c., D. Ábra és 5A., B. Ábra a teljes elemzéshez) ). A Western blotting azt is kimutatta, hogy az MCZ kezelés csökkentette a GFAP, Iba-1 és COX-2 expresszióját az LPS-sel kezelt egerek hippocampus szövetében (3a. Ábra). Megállapítottuk, hogy az MCZ-kezelés csökkentette a TNF-α (3b. Ábra), az IL-1β (3c. Ábra) és az IL-6 (3d. Ábra) mRNS-szintjét az agy hippocampus szöveteiben. Továbbá elvégezzük az ELISA-t, hogy az MCZ-kezelés szignifikánsan csökkentette a TNF-α (3e. Ábra), az IL-1β (3f. Ábra) és az IL-6 (3g. Ábra) fehérje szintjét az agy hippocampus szöveteiben.