JOP. A hasnyálmirigy folyóirata

Fumiaki Nozawa 1,2, Mehmet Yalniz 1, Murat Saruc 1,3, Jens Standop 1,4, Hiroshi Egami 2 és Parviz M Pour 1,5

1 Eppley Rákkutató Intézet. Omaha, NE, USA

2 Gasztroenterológiai Sebészeti Osztály, Orvosi Tudományok Doktori Iskola, Kumamoto Egyetem. Kumamoto, Japán

3 Hasnyálmirigy- és epebetegségek osztálya, Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Acibadem Kórház, Harvard Medical International. Bakirkoy, Isztambul, Törökország

4 Rheinsche Friedrichi-Wilhelms-University sebészeti tanszéke. Bonn, Németország

5 A Nebraskai Egyetem Orvostudományi Karának Patológiai és Mikrobiológiai Tanszéke. Omaha, NE, USA

* Levelező szerző: Parviz M Pour
Az Eppley Institute for Cancer and Allied Diseases
A Nebraskai Egyetem Orvosi Központja
986805 Nebraska Medical Center; Omaha
NE 68198-6805; USA
Telefon: +1-402.559.4495
Fax: +1-402.559.4651
Email: [e-mail védett]

Megkapta 2012. június 4. - Elfogadott 2013. január 30

Absztrakt

Kulcsszavak

Emésztés; Diéta, magas zsírtartalmú; DNS; Inzulin; Inzulinrezisztencia; Langerhans-szigetek; Pankreatin

Rövidítések

ABC: avidin-biotin-peroxidáz komplex; BRDU: bróm-dezoxiuridin; chy, kimotripszin; FPE: gombás hasnyálmirigy enzim; HF: magas zsírtartalmú; LI: címkézési index

BEVEZETÉS

ANYAG ÉS MÓDSZEREK

Állatok

Nyolc hetes tenyésztett szíriai aranyhörcsögöket használtak az Eppley telepen. A központosított összehasonlító gyógyszeres állattartó létesítményekben, a Laboratory Animal Care Assessment and Accreditation Association (AAALAC) nemzetközi akkreditált állattartó létesítményében helyezkedtek el kukoricás ágynemű műanyag ketrecekben (Bed-O-Cobs, The Anderson Cob Co., Maumee, OH, USA), standard laboratóriumi körülmények között (hőmérséklet: 21 ± 2 ° C; páratartalom: 40 ± 5%; világos/sötét ciklus: 12 óra/12 óra; 10-szeres légcsere/óra). Kereskedelmi táplálékkal etették őket (Wayne Lab Blox, Allied Mills, Chicago, IL, USA), és szabadon hozzáférhettek csapvízhez.

Az ivóvízben adott enzimek ízlelési problémáját az újszülött hörcsögök kiképzésével oldották meg [1]. Ily módon az ezen hörcsögök által elfogyasztott FPE-tartalmú víz mennyisége nem különbözött a tiszta csapvizet ivó almoktól.

Gombás hasnyálmirigy-enzim (FPE)

A mikrobiális és növényi forrásokból származó hidrolitikus enzimeknek hosszú ideje biztonságos a felhasználása az élelmiszeriparban. A vény nélkül kapható enzimek az élelmiszerek feldolgozási segédanyagaként voltak felhasználva, és mindannyian jelen voltak az élelmiszerellátásban 1994. október 15-ét megelőzően, ami szükséges az étrend-kiegészítőkben való felhasználásukhoz az FDA engedélyének benyújtása nélkül. Az FPE a National Enzyme Company jóvoltából történt (Forsyth, MO, USA). Az FPE-t, amelyet pelyhes formában juttattak szövetszaggatóba, kis sebességgel, egy gramm földelt FPE-t feloldhattak 1:10 ml vízben 4 ° C-os vízben. A friss tételt, amelyet közvetlenül a szállítás után 4 ° C-on tartottak, háromhavonta cserélték. Kéthetente feljegyezték az élelmiszer- és a víz (és az enzim) fogyasztását, és az FPE koncentrációját a testtömegnek megfelelően állították be.

Ismeretes, hogy a kereskedelmi forgalomban lévő chow-étrend étrendi összetevői tételenként jelentősen eltérnek. Különböző mennyiségű toxikus terméket is tartalmazhat, beleértve gombaölő, rovarirtó, gyomirtó szereket stb. Annak érdekében, hogy elkerüljük a kereskedelmi élelmiszerekben előforduló egyes összetevők esetleges interferenciáját, amelyek inaktiválhatják az enzimeket, félszintetikus normál és magas zsírtartalmú diéta, amiről korábban beszámoltunk [3, 4], frissen elkészítve, és legfeljebb két hétig hűvös helyiségben tárolva.

Inzulinvizsgálat

Vérmintákat vettünk a kezelés előtt és két héttel a sertés hasnyálmirigy-enzimek etetése után, és az állatokat 21 nap után leöltük. Az állatokat egy éjszakán át böjtölték, mielőtt vérmintákat vettek volna. A vért standard Eppendorf-csövekbe gyűjtöttük, amelyek 45 ml aprotenint (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA, 1 μg/ml)/ml vér és 7,5 pg EDTA-t tartalmaztak. A csöveket 15 percen belül centrifugáltuk, és a plazmát elválasztottuk, és -80 ° C-on lefagyasztottuk, amíg a korábban leírt módszerrel meg nem vizsgáltuk [5]. A vizsgálat 95% -os megbízhatósággal észlelte a változásokat a szomszédos 2 fmol inzulin/cső minták között, és nem mutat keresztreakciót az inzulinszerű növekedési faktorokkal.

A hasnyálmirigy-szigetek méretének meghatározása

A H&E festett tárgylemezeken kb. 200 véletlenszerűen kiválasztott sziget/hasnyálmirigy átmérőjét mértük mikroszkálával Zeiss Axiomat® mikroszkóppal (Zeiss, Jena, Németország). Az átlagos érték a μm 2 -ben kifejezett szigetek nagysága, és a következő képlet alapján lett kiszámítva: terület = π x (hossz a/2) x (hossz b/2).

A béta- és alfa-sejtek számának meghatározása a szigeteken

Immunhisztokémiai vizsgálatot végeztek avidin-biotin-peroxidáz komplex (ABC) módszerrel [6]. Egér anti-inzulin monoklonális antitestet és nyúl anti-glükagon poliklonális antitestet (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, USA) alkalmaztunk a festési folyamatban. Kettős immunfestést (inzulin és glükagon esetében) hajtottunk végre, amint arról beszámoltunk [7]. Ezután véletlenszerűen megszámoltuk a körülbelül 200 szigetecske béta- és alfa-sejtjeinek számát. A szigetek átlagos méretét, valamint az inzulin- és glükagonsejtek számát reprezentatív értéknek tekintettük minden hasnyálmirigy esetében.

A DNS-szintézis meghatározása hasnyálmirigy-sejtekben

Anti-bróm-dezoxiuridin (BRDU) antitest (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) alkalmazásával meghatároztuk az acinar, a ductal és a szigetecske sejtek jelölését a jelentések szerint [8]. Az antitest (Becton Dickinson, Columbus, NE, USA, USA) 1: 100 hígítású alkalmazása előtt a metszeteket 2 N HCl-ban inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on. A tárgylemezeket eozinnal ellenfestettük. A jelölési index (LI) meghatározásához legalább 100 szigetet, 10 000 acináris sejtet, duktuláris sejtet és a lehető legtöbb duktális sejtet (hörcsögökben csak néha látnak nagy csatornákat) számoltak. Csak a tipikus kör alakú és a magonként legalább öt szemcséjű szigetecske sejtek magjait tekintettük jelzettnek.

Székletzsír-elemzés

Az ürüléket Drummey [9], valamint Fine és Ogunji [10] módszereivel összegyűjtöttük és zsírra festettük, kisebb módosításokkal. Röviden, kis mennyiségű székletet helyezünk egy üveglemezre, és két csepp 36% -os ecetsavat adunk hozzá. Egy másik üveglemezt helyezünk a tetejére, és a tartalmat homogenizáljuk a két üveglemez közötti őrléssel, majd két csepp 1% -os Sudan III®-t (Rowley Biochemical Inc., Danvers, MA, USA) adunk hozzá. A tárgylemezeket kézzel tartották egy főzőlapon, amíg buborékok nem jelentek meg. Ezután a tárgylemezeket gyorsan eltávolítottuk, és további két alkalommal újramelegítettük, és mikroszkóppal megvizsgáltuk. A zsírcseppek vörös anyagként jelentek meg.

Tanulmányi jegyzőkönyv

A. kísérleti tanulmány

Dózistartomány megállapítása

A maximálisan tolerálható dózis azonosításához különböző koncentrációjú FPE-ket készítettünk. Ezen enzimek ízét és toxicitását 40 nőstény szíriai aranyhörcsög csoportban vizsgálták.

Az FPE oldhatóságát 40 ml csapvízben való hígítással vizsgáltuk. Ez a mennyiség megfelel a hörcsögök által naponta elfogyasztott mennyiségnek. A csapvízben teljesen feloldható FPE legnagyobb koncentrációját grammban (g) számoltuk, és a testtömeg (BW) kilogrammonként (kg) adtuk meg. Ez a számítás fontos volt, mivel az FPE-t a testsúly alapján szeretnénk táplálni, amely idővel változik. Ennélfogva lehetővé tenné számunkra az FPE mennyiségének növelését, amint az állatok híznak. Megállapították, hogy 2 g/kg volt a vízben oldódó FPE maximális mennyisége. Harminc nőstény hörcsögöt három kezelési csoportba osztottak, egyenként 10 állattal. Az egyik csoport csapvízben kapta az FPE-t maximális koncentrációban (Nagy dózis: 2 g/ttkg); a második csoport az adag felét kapta (közepes adag: 1 g/testtömeg-kg), a harmadik csoport pedig az adag egynegyedét (alacsony adag: 0,5 g/ttkg). Tíz hörcsög szolgált kontrollként és csak csapvizet kapott. Minden állat napi víz- és táplálékbevitelét, testtömegét és fizikai aktivitását 21 napig rögzítettük.

21 nap elteltével az összes állatot megsemmisítették, a szívüket, a máját, a veséjüket és a hasnyálmirigyüket lemérték, és a vérükben megvizsgálták az inzulint. A boncolás előtt négy órával BRDU-t injektáltak minden hörcsögnek kétszer, 5 mg/testtömeg-kg dózisban, a szigetek sejtjeiben végzett DNS-szintézis (jelölési index) vizsgálatához.

B. A gombás hasnyálmirigy-enzimek (FPE) hosszú távú kezelésének hatása

Az FPE hosszú távú hatásának vizsgálatához két különböző FPE-készítményt használtunk: egyedül az FPE-t és az FPE-t plusz kimotripszint (FPE + chy) annak megvizsgálására, hogy a hatás különbözik-e az enzimkombinációk típusai között.

Kísérleti terv

Hatvan nőstény szír hörcsögöt tápláltak magas zsírtartalmú (HF) diétával egész életükben, hathetes korukban. Négy héttel a HF diéta megkezdése után, amikor a perifériás inzulinrezisztencia biztosan kialakul, a hörcsögöket három, egyenként 20 állatból álló csoportba osztották. Az egyik csoportot csapvízben FPE-vel kezeltük 2 g/ttkg koncentrációban (HF + FPE csoport). A második csoport azonos koncentrációban kapta a kimotripszint tartalmazó FPE-t (HF + FPE + chy-csoport; a társaság nem határozta meg a kimotripszin mennyiségét), a harmadik csoport csak vizet kapott (Kontroll: HF-csoport) (1.ábra). Minden csoportból öt hörcsögöt feláldoztunk a 36. héten (1. vizsgálat), a fennmaradó 15 hörcsögöt pedig a 40. héten (2. vizsgálat). Az elpusztítás előtt BRDU-t kétszer injektáltunk minden hörcsögbe 5 mg/testtömeg-kg dózisban a szigeti sejtekben a DNS-szintézis (jelölési index) vizsgálatához. Az FPE koncentrációját a testtömegnek megfelelően állítottuk be, amelyet hetente ellenőriztünk a víz és az élelmiszer-fogyasztás mennyiségével együtt.

gombás

1.ábra. Kísérleti tervezés (1. vizsgálat: 5 hörcsög minden csoportból; 2. vizsgálat: 15 hörcsög minden csoportból).
BrdU: bróm-dezoxiuridin; chy: kimotripszin addíció; FPE: gombás hasnyálmirigy enzim kezelés

Meghatározták a testtömeget, a víz és az étkezés mennyiségét, a plazma inzulinszintet, a szigetecske méretét és az egyes szigetek sejtjeinek számát, valamint a szigeti sejtek jelölési indexét. A széklet zsírtartalmának fokozatát, amelyet hetente egyszer gyűjtöttünk össze, szubjektív szemikvantitatív skála alapján osztályoztuk -, +, ++ és +++. A plazma inzulinszint és a szigetecske méretéhez a kereskedelemben táplált hörcsögökről (NP Group) vonatkozó archív adatainkat is felhasználtuk.

STATISZTIKA

Az adatok átlag és szórás (SD) formájában vannak feltüntetve. A testtömeg, az élelmiszer-fogyasztás és a vízbevitel statisztikai elemzését ANOVA alkalmazásával végeztük. Ha bármilyen jelentős különbség jelentkezett, akkor elvégeztük a Tukey-Kramer tesztet. A vizsgált paraméterek (azaz a szigetecske) számát, nem pedig az állatok számát vettük mintaméretnek minden számítás során. Például a szigetek méretére 200 szigetecske/hasnyálmirigy volt a minta mérete. Statisztikai csomagként a MATLAB-ot (7.10.0 verzió, The MathWorks Inc., Natick, MA, 2010) használták. Két 0,05-nél kisebb farok P értéket tekintettünk statisztikailag szignifikánsnak.

ETIKA

Az ebben a javasolt vizsgálatban részt vevő állatok fenntartása és humánus bánásmódja a Nebrascai Egyetem Orvosi Központjának (UNMC) Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) útmutatásait követte, és ezen állatok esetleges kellemetlenségei és sérülései csak arra korlátozódtak megkerülhetetlen a tudományos szempontból értékes kutatások során. Az eutanázia módszere összhangban állt az American Veterinary Medical Association (AVMA) eutanáziáról szóló iránymutatásainak ajánlásával. A fájdalom jeleit mutató hörcsögöket CO2 feláldozta.

EREDMÉNYEK

A. kísérleti tanulmány

Test és szerv súlyok

A közepes dózisú csoportban a kísérlet végén értékelt testtömeg (121,6 ± 11,5 g) szignifikánsan alacsonyabb volt (P = 0,014), mint a kontrollcsoporté (138,6 ± 17,1 g), míg a kontrollcsoporttal nem volt szignifikáns különbség. a magas dózisú (152,0 ± 45,0 g, P = 0,052) és az alacsony dózisú (138,2 ± 8,0 g, P = 0,056) csoportokat találtuk. Ezenkívül a közepes dózisú csoport testtömege is szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az alacsony dózisú csoporté (P = 0,051).

A hasnyálmirigy átlagos tömege szignifikánsan kisebb volt a nagy dózisú csoportban (0,770 ± 0,268 g), mint a többi csoportban (közepes dózis: 1,146 ± 0,268 g, P = 0,023; alacsony dózis: 1,356 ± 0,268 g, P 2; P 2; P = 0,016), mint a kontroll csoportban (169,1 ± 96,1 μm 2). Bár az alacsony dózisú csoportban a szigetek mérete (171,7 ± 96,9 μm 2) nagyobb volt, mint a kontroll csoportban, a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (P = 0,542; 2. ábra).

2. ábra. A szíriai aranyhörcsögök szigeteinek mérete különböző koncentrációjú gombás hasnyálmirigy-enzimmel (FPE) táplálkozott. Az adatokat átlag ± SD-ként mutatjuk be. P értékek a kontrollcsoporttal szemben.

Acinar és szigetsejtek DNS-szintézise

Noha az FPE befolyásolta a nagy dózisú csoport szigeteinek méretét, a DNS szintézisének sebessége nem szolgáltatott érdemi adatokat a LI számának figyelemre méltóan nagy egyéni variációi miatt. Korábbi vizsgálataink során megfigyeltük ezeket a variációkat, különösen az acináris sejtekben, amelyek szintén jelentősen változnak ugyanazon a hasnyálmirigyen belül. Ugyanez igaz a plazma inzulinszintjére is. Bár a LI és az inzulinszint alacsonyabb volt a nagy dózisú csoportban, a különbség nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Ezért az ilyen vizsgálatokhoz sokkal nagyobb számú állatra van szükség a megbízhatóbb adatok összegyűjtéséhez.

Acinar sejtek címkézési indexe

A nagy dózisú csoport kivételével az összes csoportban az acináris sejtek LI-értéke szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll csoportban (0,950 ± 1,184) (azaz közepes dózis: 1,910 ± 3,854, P = 0,018; alacsony dózis: 1,680 ± 2,399, P = 0,007). Noha a LI nagyobb volt a nagy dózisú csoportban (1.000 ± 1.318), mint a kontroll csoportban, a különbség nem volt szignifikáns (P = 0.869; 3. ábra).

3. ábra. Az acináris sejtek jelölési indexe a szíriai aranyhörcsögökben különböző koncentrációjú gombás hasnyálmirigy-enzimmel (FPE) táplálták. Az adatokat átlag ± SD-ként mutatjuk be. P értékek a kontrollcsoporttal szemben.

Szigetecske sejtek címkézési indexe

Valamennyi csoportban a szigeti sejtek LI-értéke alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportban. A különbségek azonban nem voltak szignifikánsak (Magas dózis: P = 0,649; Közepes dózis: P = 0,410; Alacsony dózis: P = 0,542; vs. kontrollcsoport) (4. ábra és 1. táblázat).

4. ábra. A szíriai aranyhörcsögök szigetsejtjeinek jelölési indexe különböző koncentrációjú gombás hasnyálmirigy-enzimmel (FPE) táplálták. Az adatokat átlag ± SD-ként mutatjuk be. P értékek a kontrollcsoporttal szemben.

Inzulinszint

Nem találtunk szignifikáns különbséget a kezelt csoportok plazma inzulinszintje és a kontroll csoport szintje között (1,255 ± 0,857 ng/ml). Különösen a nagy dózisú csoportban a plazma inzulinszint alacsonyabb volt (0,948 ± 0,270 ng/ml, P = 0,318); a közepes dózisú csoportban magasabb volt (1,507 ± 1,078 ng/ml, P = 0,613), az alacsony dózisú csoportban alacsonyabb (0,720 ± 0,250 ng/ml, P = 0,167), mint a kontroll csoportban (5. ábra).

5. ábra. A plazma inzulinszint a szíriai aranyhörcsögökben különböző koncentrációjú gombás hasnyálmirigy-enzimmel (FPE) táplálták. Az adatokat átlag ± SD-ként mutatjuk be. P értékek a kontrollcsoporttal szemben.

B. A gombás hasnyálmirigy-enzimek (FPE) hosszú távú kezelésének hatása

Víz- és élelmiszer-bevitel

A HF + FPE + chy-táplált hörcsögök kevesebb vizet fogyasztottak a 0. időpontban, valamint 24. és 28. hét után, valamint a HF + FPEfed hörcsögök kevesebb vizet fogyasztottak a 0. és 12. hét után, összehasonlítva a HF-vel táplált hörcsögökkel. A HF + FPE + chy csoport által elfogyasztott víz mennyisége szignifikánsan magasabb volt, mint a HF + FPE csoportnál 32 és 36 hét után (6. ábra). Valamennyi hörcsög azonos mennyiségű ételt fogyasztott (7. ábra).

6. ábra. A napi vízfogyasztás a szíriai aranyhörcsögökben magas zsírtartalmú (HF) étrendet tápláltak és gombás hasnyálmirigy-enzimmel (FPE) kezeltek, kimotripszin hozzáadásával és anélkül. A dobozban lévő vonal a mediánt (50. percentilis), a mező alja és teteje pedig az eloszlás 25., illetve 75 százalékát jelöli (interkvartilis tartomány). A bajusz a maximális és a minimális megfigyelt értékig terjed. * Jelentős különbség (P

  • itthon
  • Ról ről
  • Folyóiratok
  • Cikkek
  • Szerkesztők
  • Szerzői
  • Lektorok
  • Lépjen kapcsolatba velünk